קביעת ספרואידים תלת מימדיים מדגימות גידול שמקורן בחולה והערכת רגישותם לתרופות
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר יצירת מודלים תלת-ממדיים של תרביות גידול מתאי סרטן ראשוניים והערכת רגישותם לתרופות באמצעות בדיקות כדאיות תאים ובדיקות מיקרוסקופיות.
Abstract
למרות התקדמות מרשימה בהבנת הביולוגיה של הגידול, הרוב המכריע של התרופות האונקולוגיות המועמדות לניסויים קליניים נכשלים, לעתים קרובות בשל חוסר יעילות קלינית. שיעור כישלון גבוה זה מאיר את חוסר יכולתם של המודלים הפרה-קליניים הנוכחיים לחזות יעילות קלינית, בעיקר בשל חוסר יכולתם לשקף את הטרוגניות הגידול ואת המיקרו-סביבה של הגידול. ניתן לטפל במגבלות אלה באמצעות מודלים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) של תרבית (ספרואידים) שהוקמו מדגימות גידול אנושיות שמקורן בחולים בודדים. תרביות תלת-ממדיות אלה מייצגות ביולוגיה של העולם האמיתי טוב יותר מאשר קווי תאים מבוססים שאינם משקפים הטרוגניות של הגידול. יתר על כן, תרביות תלת-ממדיות טובות יותר ממודלים של תרביות דו-ממדיות (2D) (מבנים חד-שכבתיים) מכיוון שהן משכפלות אלמנטים של סביבת הגידול, כגון היפוקסיה, נמק והיצמדות תאים, ומשמרים את צורת התא הטבעית ואת צמיחתה. במחקר הנוכחי פותחה שיטה להכנת תרביות ראשוניות של תאים סרטניים מחולים בודדים שהם תלת ממדיים וגדלים בכדוריות רב-תאיות. התאים יכולים להיגזר ישירות מגידולים של חולים או xenografts שמקורם בחולה. השיטה ישימה באופן נרחב לגידולים מוצקים (למשל, מעי גס, שד וריאות) והיא גם חסכונית, מכיוון שניתן לבצע אותה בשלמותה במעבדה טיפוסית לחקר הסרטן / ביולוגיה של התא מבלי להסתמך על ציוד מיוחד. כאן מוצג פרוטוקול ליצירת מודלים תלת-ממדיים של תרביות גידולים (ספרואידים רב-תאיים) מתאי סרטן ראשוניים ולהערכת רגישותם לתרופות באמצעות שתי גישות משלימות: בדיקת כדאיות התא (MTT) ובדיקות מיקרוסקופיות. ניתן להשתמש בספרואידים רב-תאיים אלה כדי להעריך מועמדים פוטנציאליים לתרופה, לזהות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים או מטרות טיפוליות, ולחקור את מנגנוני התגובה והעמידות.
Introduction
מחקרי In vitro ו-in vivo מייצגים גישות משלימות לפיתוח טיפולים לסרטן. מודלים במבחנה מאפשרים שליטה ברוב משתני הניסוי ומאפשרים ניתוחים כמותיים. לעתים קרובות הם משמשים כפלטפורמות סינון בעלות נמוכה וניתן להשתמש בהם גם למחקרים מכניסטיים1. עם זאת, הרלוונטיות הביולוגית שלהם מוגבלת מטבעה, שכן מודלים כאלה משקפים רק חלקית את המיקרו-סביבה של הגידול1. לעומת זאת, מודלים in vivo, כגון xenografts שמקורם במטופל (PDX), לוכדים את המורכבות של המיקרו-סביבה של הגידול ומתאימים יותר למחקרים תרגומיים ולטיפול אינדיבידואלי בחולים (כלומר, חקירת התגובה לתרופות במודל הנגזר ממטופל בודד)1. עם זאת, מודלים in vivo אינם תורמים לגישות בעלות תפוקה גבוהה לסינון תרופות, מכיוון שלא ניתן לשלוט בפרמטרים הניסיוניים בצורה הדוקה כמו במודלים במבחנה ומכיוון שפיתוחם גוזל זמן, דורש עבודה ויקר 1,2.
מודלים במבחנה זמינים כבר מעל 100 שנה, וקווי תאים זמינים מעל 70 שנה3. במהלך העשורים האחרונים, עם זאת, המורכבות של מודלים זמינים במבחנה של גידולים מוצקים גדל באופן דרמטי. מורכבות זו נעה בין מודלים דו-ממדיים (דו-ממדיים) של תרבית (מבנים חד-שכבתיים) שהם קווי תאים מבוססים שמקורם בגידול או קווי תאים ראשוניים ועד לגישות עדכניות יותר הכוללות מודלים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים)1. בתוך המודלים הדו-ממדיים, הבחנה מרכזית היא בין קווי התאים המבוססים והראשוניים4. קווי תאים מבוססים מונצחים; לכן, אותו קו תאים יכול לשמש באופן גלובלי לאורך שנים רבות, אשר בפרספקטיבה היסטורית, מאפשר שיתוף פעולה, הצטברות נתונים, ופיתוח אסטרטגיות טיפול רבות. עם זאת, סטיות גנטיות בקווי תאים אלה מצטברות עם כל מעבר, ובכך פוגעות ברלוונטיות הביולוגית שלהם. יתר על כן, המספר המוגבל של שורות תאים זמינות אינו משקף את ההטרוגניות של גידולים בחולים 4,5. קווי תאים סרטניים ראשוניים נגזרים ישירות מדגימות גידול שנכרתו המתקבלות באמצעות ביופסיות, עירוי פלאורלי או כריתות. לכן, קווי תאים סרטניים ראשוניים רלוונטיים יותר מבחינה ביולוגית מכיוון שהם משמרים אלמנטים של מיקרו-סביבה של הגידול ומאפייני הגידול, כגון התנהגויות בין-תאיות (למשל, דיבור צולב בין תאים בריאים וסרטניים) ופנוטיפים דמויי גזע של תאים סרטניים. עם זאת, יכולת השכפול של קווי תאים ראשוניים מוגבלת, מה שמוביל לזמן תרבית צר ומגביל את מספר תאי הגידול שניתן להשתמש בהם לאנליזות 4,5.
מודלים המשתמשים בתרביות תלת-ממדיות רלוונטיים יותר מבחינה ביולוגית מאשר מודלים של תרביות דו-ממדיות מכיוון שתנאי in vivo נשמרים. לפיכך, מודלים של תרבית תלת ממדית משמרים את צורת התא הטבעית ואת צמיחתה ומשכפלים אלמנטים של סביבת הגידול, כגון היפוקסיה, נמק והיצמדות תאים. המודלים התלת-ממדיים הנפוצים ביותר בחקר הסרטן כוללים ספרואידים רב-תאיים, מבנים מבוססי פיגומים ותרביות משובצות מטריצה 4,6,7.
הפרוטוקול הנוכחי מייצר מודלים תלת-ממדיים של תרביות גידולים (ספרואידים רב-תאיים) מתאי סרטן ראשוניים ומעריך את רגישותם לתרופות באמצעות שתי גישות משלימות: בדיקת כדאיות התא (MTT) ובדיקות מיקרוסקופיות. התוצאות המייצגות המוצגות כאן הן מסרטן השד והמעי הגס; עם זאת, פרוטוקול זה ישים באופן נרחב לסוגי גידולים מוצקים אחרים (למשל, כולנגיוקרצינומה, סרטן קיבה, ריאות ולבלב) והוא גם חסכוני, מכיוון שניתן לבצע אותו במלואו במעבדה טיפוסית לחקר הסרטן / ביולוגיה של התא מבלי להסתמך על ציוד מיוחד. הספרואידים הרב-תאיים הנוצרים באמצעות גישה זו יכולים לשמש להערכת מועמדים פוטנציאליים לתרופה, לזהות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים או מטרות טיפוליות, ולחקור את מנגנוני התגובה והעמידות.
פרוטוקול זה מחולק לשלושה חלקים: (1) ייצור, איסוף וספירה של הספרואידים לקראת השימוש בהם כמודל לבדיקת יעילות התרופה; (2) בדיקת MTT להערכת יעילות התרופה על הספרואידים; ו-(3) הערכה מיקרוסקופית של שינויים מורפולוגיים בעקבות הטיפול בכדורידים בתרופות כגישה נוספת להערכת יעילות התרופה (איור 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה ליצירת תרביות תאים ראשוניות תלת-ממדיות (ספרואידים) שמקורן בדגימות גידול אנושיות. ספרואידים אלה יכולים לשמש לניתוחים שונים, כולל הערכת מועמדים פוטנציאליים לתרופות ושילובי תרופות, זיהוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים או מטרות טיפוליות, וחקירת מנגנוני התגובה…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ללא.
Materials
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann – La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
Referências
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
- Richter, M., et al. From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).
- Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy. Revista de Investigación Clínica. 71 (6), 369-380 (2019).
- Choi, J. R., et al. In vitro human cancer models for biomedical applications. Cancers. 14 (9), 2284 (2022).
- Eglen, R. M., Randle, D. H. Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).
- Kodack, D. P., et al. Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care. Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).
- Moskovits, N., et al. Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types. Cancer Letters. 536, 215665 (2022).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
- Brajša, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jelić, D. Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery. Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).
- Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: The MTT assay. Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).
- Walzl, A., et al. The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).
