환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가
Summary
현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델을 생성하고 세포 생존력 분석 및 현미경 검사를 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하는 것을 설명합니다.
Abstract
종양 생물학에 대한 이해의 놀라운 발전에도 불구하고, 임상 시험에 참여하는 종양학 약물 후보의 대다수는 종종 임상 효능의 부족으로 인해 실패합니다. 이 높은 실패율은 주로 종양 이질성과 종양 미세 환경을 반영하는 데 부적절하기 때문에 현재 전임상 모델이 임상 효능을 예측할 수 없음을 보여줍니다. 이러한 한계는 개별 환자에서 추출한 인간 종양 샘플에서 확립된 3차원(3D) 배양 모델(스페로이드)로 해결할 수 있습니다. 이러한 3D 배양은 종양 이질성을 반영하지 않는 기존 세포주보다 실제 생물학을 더 잘 나타냅니다. 또한 3D 배양은 저산소증, 괴사 및 세포 부착과 같은 종양 환경의 요소를 복제하고 자연적인 세포 형태 및 성장을 보존하기 때문에 2차원(2D) 배양 모델(단층 구조)보다 우수합니다. 본 연구에서는 3D 및 다세포 스페로이드에서 성장하는 개별 환자로부터 암세포의 1차 배양물을 제조하는 방법을 개발했습니다. 세포는 환자 종양 또는 환자 유래 이종이식으로부터 직접 유래될 수 있다. 이 방법은 고형 종양(예: 결장, 유방 및 폐)에 광범위하게 적용할 수 있으며 전문 장비에 의존하지 않고 일반적인 암 연구/세포 생물학 실험실에서 전체를 수행할 수 있으므로 비용 효율적입니다. 여기에서는 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델(다세포 스페로이드)을 생성하고 세포 생존력 분석(MTT)과 현미경 검사라는 두 가지 보완 접근 방식을 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이러한 다세포 스페로이드는 잠재적인 약물 후보를 평가하고, 잠재적인 바이오마커 또는 치료 표적을 식별하고, 반응 및 내성 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
시험관 내 및 생체 내 연구는 암 치료법 개발을 위한 보완적인 접근 방식을 나타냅니다. 체외 모델은 대부분의 실험 변수를 제어하고 정량적 분석을 용이하게 합니다. 그들은 종종 저비용 스크리닝 플랫폼 역할을 하며 기계론적 연구에도 사용할 수 있습니다1. 그러나, 이들의 생물학적 관련성은 본질적으로 제한적인데, 그러한 모델은 종양 미세환경을 부분적으로만 반영하기 때문이다1. 대조적으로, 환자 유래 이종이식(PDX)과 같은 생체 내 모델은 종양 미세 환경의 복잡성을 포착하고 환자의 중개 연구 및 개별화 치료(즉, 개별 환자에서 파생된 모델에서 약물에 대한 반응 조사)에 더 적합합니다1. 그러나 생체 내 모델은 실험 매개 변수를 시험관 내 모델만큼 엄격하게 제어 할 수 없으며 개발에 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 비용이 많이 들기 때문에 약물 스크리닝을위한 고 처리량 접근법에 도움이되지 않습니다 1,2.
시험관 내 모델은 100년 이상 사용되어 왔으며 세포주는 70년 이상 사용되어 왔습니다3. 그러나 지난 수십 년 동안 고형 종양의 시험관 내 모델의 복잡성이 극적으로 증가했습니다. 이러한 복잡성은 종양 유래 확립된 세포주 또는 1차 세포주인 2차원(2D) 배양 모델(단층 구조)에서 3차원(3D) 모델을 포함하는 최신 접근 방식에 이르기까지 다양합니다1. 2D 모델 내에서, 확립된 세포주와 일차 세포주 사이의 중요한 차이점이 있다4. 확립 된 세포주는 불멸화됩니다. 따라서 동일한 세포주를 수년에 걸쳐 전 세계적으로 사용할 수 있으며, 이는 역사적 관점에서 협업, 데이터 축적 및 많은 치료 전략의 개발을 용이하게 합니다. 그러나 이러한 세포주의 유전적 이상은 모든 통과와 함께 축적되어 생물학적 관련성을 손상시킵니다. 또한, 이용가능한 세포주의 제한된 수는 환자에서 종양의 이질성을 반영하지 않는다 4,5. 원발성 암 세포주는 생검, 흉막 삼출액 또는 절제를 통해 얻은 절제된 종양 샘플에서 직접 파생됩니다. 따라서 원발성 암 세포주는 종양 미세 환경 및 종양 특성의 요소, 예를 들어 세포간 행동(예: 건강한 세포와 암세포 간의 누화) 및 암세포의 줄기 유사 표현형을 보존하기 때문에 생물학적으로 더 관련이 있습니다. 그러나, 일차 세포주의 복제 능력은 제한되어 있어 배양 시간이 짧아지고 분석에 사용할 수 있는 종양 세포의 수가 제한된다 4,5.
3D 배양을 사용하는 모델은 생체 내 조건이 유지되기 때문에 2D 배양 모델보다 생물학적으로 더 관련성이 높습니다. 따라서 3D 배양 모델은 자연적인 세포 형태와 성장을 보존하고 저산소증, 괴사 및 세포 부착과 같은 종양 환경의 요소를 복제합니다. 암 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 3D 모델에는 다세포 스페로이드, 스캐폴드 기반 구조 및 매트릭스 내장 배양이 포함됩니다 4,6,7.
현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델(다세포 스페로이드)을 생성하고 세포 생존력 분석(MTT)과 현미경 검사의 두 가지 보완 접근 방식을 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가합니다. 본원에 제시된 대표적인 결과는 유방암 및 결장암; 그러나 이 프로토콜은 다른 고형 종양 유형(예: 담관암, 위암, 폐암 및 췌장암)에 광범위하게 적용할 수 있으며 전문 장비에 의존하지 않고 일반적인 암 연구/세포 생물학 실험실에서 전체를 수행할 수 있기 때문에 비용 효율적입니다. 이 접근법을 사용하여 생성된 다세포 스페로이드는 잠재적인 약물 후보를 평가하고, 잠재적인 바이오마커 또는 치료 표적을 식별하고, 반응 및 내성 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 세 부분으로 나뉩니다: (1) 약물 효능을 테스트하기 위한 모델로 사용하기 위한 준비에서 스페로이드의 생성, 수집 및 계수; (2) 스페로이드에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 MTT 분석; (3) 약물 효능을 평가하기 위한 또 다른 접근 방식으로서 스페로이드를 약물로 처리한 후 형태학적 변화를 현미경으로 평가합니다(그림 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
본 프로토콜은 인간 종양 샘플로부터 유래된 3D 일차 세포 배양물(스페로이드)을 생성하기 위한 간단한 방법을 설명한다. 이러한 스페로이드는 잠재적인 약물 후보 및 약물 조합 평가, 잠재적인 바이오마커 또는 치료 표적 식별, 반응 및 내성 메커니즘 조사를 포함한 다양한 분석에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 환자 샘플에서 직접 파생된 원발성 종양 세포 또는 환자 샘플을 사용하여 확립?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
없음.
Materials
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann – La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
Referências
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