表征胎儿小鼠结构性心脏缺陷的管道
Summary
本文详细介绍了使用胎儿超声心动图、尸检和使用会落共聚焦显微镜 （ECM） 的会射荧光图像捕获 （EFIC） 然后进行三维 （3D） 重建的小鼠先天性心脏病 （CHD） 诊断方法。
Abstract
先天性心脏病（CHD）是美国婴儿死亡的主要原因。在1980年代及更早，大多数中度或重度冠心病患者在成年前死亡，死亡率在出生后第一周最高。手术技术、诊断方法和医疗管理方面的显着进步导致结果的显着改善。为了满足了解先天性心脏缺陷的关键研究需求，小鼠模型提供了一个理想的研究平台，因为它们的心脏解剖结构与人类非常相似，妊娠率短。基因工程与高通量表型工具的结合允许复制和诊断结构性心脏缺陷，以进一步阐明冠心病背后的分子途径。使用无创胎儿超声心动图筛选小鼠模型中的心脏表型，再加上使用具有三维（3D）重建的会射共聚焦显微镜（ECM）组织病理学的高保真会下荧光图像捕获（EFIC），可以详细查看各种先天性心脏缺陷的解剖结构。该协议概述了这些方法的完整工作流程，以获得小鼠先天性心脏缺陷的准确诊断。将这种表型方案应用于模型生物体将允许准确的冠心病诊断，从而深入了解冠心病的机制。确定冠心病的潜在机制为潜在的治疗和干预提供了机会。
Introduction
先天性心脏病（CHDs）是最常见的新生儿出生缺陷1，2，影响约0.8%-1.7%的新生儿，导致显着的新生儿死亡率和发病率3。冠心病4，5 强烈提示遗传病因。转基因小鼠模型已被广泛用于了解冠心病的复杂性以及导致冠心病的机制，因为小鼠在小鼠和人类胎儿中具有四腔心脏和可比的心脏发育DNA序列6。鉴定小鼠突变体的表型是表征靶基因功能的基本第一步。表达基因剂量效应的小鼠模型，其中单个基因突变可导致一系列模仿人类冠心病的心脏缺陷，对于理解冠心病的复杂性和导致它们的机制非常重要。
本文概述了表征小鼠模型中心脏表型的管道。应用的方法利用胎儿超声心动图7，然后是尸检和ECM组织病理学7，8，可以显示发育中的小鼠心脏表型的详细解剖结构。胎儿超声心动图是一种无创方式，允许以合理的成像分辨率直接可视化多个胚胎。此外，胎儿超声心动图可以快速确定一窝胚胎的总数、它们的发育阶段以及子宫角中的相对方向和位置。使用光谱多普勒/彩色血流，可以根据结构、血流动力学紊乱、生长受限或水肿的发展来识别异常胚胎。由于胎儿超声心动图研究是一种非侵入性技术，因此可用于多天扫描并观察血流动力学或心脏形态的变化。获得胎儿超声心动图的高质量成像需要实践和技能，因为由于缺乏经验和知识，可能会错过特定的心脏缺陷。因此，可以通过尸检和ECM组织病理学的组合获得更明确的心脏形态分析。尸检可直接显示弓结构、主动脉和肺动脉的相对关系、心室和心房的大小、心脏相对于胸部的位置以及支气管肺结构。然而，心脏瓣膜和壁厚等内部特征可能难以仅通过尸检进行评估。因此，建议将 ECM 组织病理学检查作为结论性诊断。ECM组织病理学是一种高分辨率可视化技术，允许对图像堆栈9进行2D和3D重建。这些图像是通过石蜡包埋样品的连续落射荧光成像获得的，因为它通过自动切片机以一致的间隔进行薄切。与经典组织学不同，图像在从块中切割之前被捕获为一个部分，以便在同一参考系内捕获所有图像。因此，ECM组织病理学产生的2D图像堆栈可以在三维空间中轻松可靠地重建。这是使用 DICOM 查看器完成的，该查看器允许在三个解剖平面（冠状面、矢状面和横向）中对图像进行 3D 可视化。通过这些高分辨率的3D重建，可以做出明确的心脏诊断。这三种不同的可视化模式的应用，无论是单独还是组合，都可以准确表征小鼠胚胎中的结构性心脏缺陷。
Protocol
Representative Results
Discussion
转基因小鼠已被用于了解先天性心脏缺陷的病理机制。我们在这项研究中提供的协议试图简化和标准化评估鼠胎儿心脏缺陷的过程。但是，在协议过程中需要注意一些关键步骤。小鼠胚胎在妊娠的每一天都显着生长，并且可以通过准确执行胎儿超声心动图来确定收获小鼠的正确时间。胎儿超声心动图可用于筛查胎儿心血管病理。2D图像允许识别异常的解剖结构和心脏功能，在彩色多普勒的帮助下?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
没有。
Materials
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
Referências
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