Eine Pipeline zur Charakterisierung struktureller Herzfehler in der fetalen Maus
Summary
Dieser Artikel beschreibt die diagnostischen Methoden der angeborenen Herzfehler (KHK) der Maus unter Verwendung der fetalen Echokardiographie, der Nekropsie und der episkopischen Fluoreszenzbilderfassung (EFIC) unter Verwendung der episkopischen konfokalen Mikroskopie (ECM), gefolgt von einer dreidimensionalen (3D) Rekonstruktion.
Abstract
Angeborene Herzfehler (KHK) sind die Hauptursachen für den Tod von Säuglingen in den Vereinigten Staaten. In den 1980er Jahren und früher starben die meisten Patienten mit mittelschwerer oder schwerer KHK vor dem Erwachsenenalter, wobei die maximale Mortalität in der ersten Lebenswoche lag. Bemerkenswerte Fortschritte bei chirurgischen Techniken, diagnostischen Ansätzen und medizinischem Management haben zu deutlichen Verbesserungen der Ergebnisse geführt. Um den kritischen Forschungsbedarf des Verständnisses von angeborenen Herzfehlern zu decken, haben Mausmodelle eine ideale Forschungsplattform geschaffen, da sie eine sehr ähnliche Herzanatomie wie der Mensch und kurze Schwangerschaftsraten aufweisen. Die Kombination von Gentechnik mit Hochdurchsatz-Phänotypisierungswerkzeugen hat die Replikation und Diagnose von strukturellen Herzfehlern ermöglicht, um die molekularen Signalwege hinter KHK weiter aufzuklären. Der Einsatz der nicht-invasiven fetalen Echokardiographie zum Screening der kardialen Phänotypen in Mausmodellen in Verbindung mit der hohen Genauigkeit der episkopischen Fluoreszenzbilderfassung (EFIC) mittels episkopischer konfokaler Mikroskopie (ECM) Histopathologie mit dreidimensionalen (3D) Rekonstruktionen ermöglicht einen detaillierten Einblick in die Anatomie verschiedener angeborener Herzfehler. Dieses Protokoll beschreibt einen vollständigen Arbeitsablauf dieser Methoden, um eine genaue Diagnose von angeborenen Herzfehlern der Maus zu erhalten. Die Anwendung dieses Phänotypisierungsprotokolls auf Modellorganismen ermöglicht eine genaue KHK-Diagnose und liefert Einblicke in die Mechanismen der KHK. Die Identifizierung der zugrunde liegenden Mechanismen der KHK bietet Möglichkeiten für mögliche Therapien und Interventionen.
Introduction
Angeborene Herzfehler (KHK) sind die häufigsten neonatalen Geburtsfehler 1,2, von denen etwa 0,8 % bis 1,7 % der Neugeborenen betroffen sind und die zu einer signifikanten Mortalität und Morbidität bei Neugeborenen führen3. Eine genetische Ätiologie ist bei KHK 4,5 stark indiziert. Genetisch veränderte Mausmodelle wurden in großem Umfang verwendet, um die Komplexität von KHK und die Mechanismen zu verstehen, die sie verursachen, da die Mäuse Vierkammerherzen und vergleichbare kardiale Entwicklungs-DNA-Sequenzen bei Maus- und menschlichen Föten haben6. Die Identifizierung des Phänotyps der Mausmutanten ist der grundlegende erste Schritt, um die Funktion des Zielgens zu charakterisieren. Mausmodelle, die Gendosiseffekte ausdrücken, bei denen eine einzige genetische Mutation zu einem Spektrum von Herzfehlern führen kann, die menschliche KHK nachahmen, sind wichtig, um die Komplexität von KHK und die Mechanismen, die sie verursachen, zu verstehen.
Dieser Artikel skizziert eine Pipeline zur Charakterisierung kardialer Phänotypen in Mausmodellen. Die angewandten Methoden verwenden das fetale Echokardiogramm 7, gefolgt von der Nekropsie und der EZM-Histopathologie 7,8, die die detaillierte Anatomie der sich entwickelnden murinen Herzphänotypen darstellen können. Ein fetales Echokardiogramm ist eine nichtinvasive Methode, die eine direkte Visualisierung mehrerer Embryonen mit angemessener Bildauflösung ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht ein fetales Echokardiogramm eine schnelle Bestimmung der Gesamtzahl der Embryonen in einem Wurf, ihrer Entwicklungsstadien sowie der relativen Orientierung und Lage im Gebärmutterhorn. Mit einem spektralen Doppler/Farbfluss können abnorme Embryonen anhand der Struktur, der hämodynamischen Störung, der Wachstumseinschränkung oder der Entwicklung von Hydrops identifiziert werden. Da es sich bei einer fetalen Echokardiogramm-Studie um eine nichtinvasive Technik handelt, kann sie verwendet werden, um an mehreren Tagen zu scannen und die Veränderungen der Hämodynamik oder der Herzmorphologie zu beobachten. Die Erstellung einer qualitativ hochwertigen Bildgebung von fetalen Echokardiogrammen erfordert Übung und Geschicklichkeit, da bestimmte Herzfehler aufgrund mangelnder Erfahrung und mangelnden Wissens übersehen werden können. Aus diesem Grund kann eine definitivere Analyse der Herzmorphologie durch eine Kombination von Nekropsie und EZM-Histopathologie erhalten werden. Die Nekropsie ermöglicht die direkte Visualisierung der Bogenstruktur, der relativen Beziehungen der Aorta und der Lungenarterie, der Größe der Ventrikel und Vorhöfe, der Position des Herzens relativ zur Brust und der bronchopulmonalen Strukturen. Innere Merkmale wie die Herzklappen und die Wandstärke können jedoch durch Obduktion allein schwer zu beurteilen sein. Daher wird die EZM-Histopathologie für eine schlüssige Diagnose empfohlen. Die ECM-Histopathologie ist eine hochauflösende Visualisierungstechnik, die sowohl eine 2D- als auch eine 3D-Rekonstruktion des Bildstapelsermöglicht 9. Diese Bilder werden durch serielle episkopische Fluoreszenzbildgebung einer in Paraffin eingebetteten Probe erhalten, während sie in einem konsistenten Intervall durch ein automatisches Mikrotom dünn geschnitten wird. Im Gegensatz zur klassischen Histologie werden Bilder als Ausschnitt erfasst, bevor sie aus dem Block herausgeschnitten werden, so dass alle Bilder innerhalb desselben Bezugssystems erfasst werden. Dadurch kann der von der ECM-Histopathologie erzeugte 2D-Bildstapel einfach und zuverlässig dreidimensional rekonstruiert werden. Dies geschieht mit einem DICOM-Viewer, der eine 3D-Visualisierung der Bilder in den drei anatomischen Ebenen ermöglicht: koronale, sagittal und transversal. Aus diesen hochauflösenden 3D-Rekonstruktionen kann eine definitive Herzdiagnose gestellt werden. Die Anwendung dieser drei verschiedenen Visualisierungsmodalitäten, entweder einzeln oder in Kombination, kann genaue Charakterisierungen von strukturellen Herzfehlern in Mausembryonen liefern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genetisch veränderte Mäuse wurden verwendet, um die Pathomechanismen von angeborenen Herzfehlern zu verstehen. Die Protokolle, die wir in dieser Studie zur Verfügung stellen, versuchen, den Prozess der Beurteilung von fetalen Herzfehlern der Maus zu rationalisieren und zu standardisieren. Es gibt jedoch kritische Schritte, die während des Protokolls zu beachten sind. Mausembryonen wachsen an jedem Tag der Schwangerschaft signifikant, und der richtige Zeitpunkt für die Ernte einer Maus kann durch ein fetales Echokard…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nichts.
Materials
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
Referências
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