भ्रूण माउस में संरचनात्मक हृदय दोषों को चिह्नित करने के लिए एक पाइपलाइन
Summary
यह लेख एपिस्कोपिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (ईसीएम) का उपयोग करके भ्रूण इकोकार्डियोग्राफी, नेक्रोपसी और एपिस्कोपिक फ्लोरेसेंस इमेज कैप्चर (ईएफआईसी) का उपयोग करके मुराइन जन्मजात हृदय रोग (सीएचडी) नैदानिक विधियों का विवरण देता है, जिसके बाद त्रि-आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण होता है।
Abstract
जन्मजात हृदय रोग (सीएचडी) संयुक्त राज्य अमेरिका में शिशु मृत्यु के प्रमुख कारण हैं। 1980 के दशक में और उससे पहले, मध्यम या गंभीर सीएचडी वाले अधिकांश रोगियों की वयस्कता से पहले मृत्यु हो गई, जीवन के पहले सप्ताह के दौरान अधिकतम मृत्यु दर के साथ। सर्जिकल तकनीकों, नैदानिक दृष्टिकोण और चिकित्सा प्रबंधन में उल्लेखनीय प्रगति ने परिणामों में उल्लेखनीय सुधार किया है। जन्मजात हृदय दोषों को समझने की महत्वपूर्ण शोध आवश्यकताओं को संबोधित करने के लिए, मुराइन मॉडल ने एक आदर्श शोध मंच प्रदान किया है, क्योंकि उनके पास मनुष्यों के समान हृदय शरीर रचना विज्ञान और कम गर्भधारण दर है। उच्च-थ्रूपुट फेनोटाइपिंग टूल के साथ जेनेटिक इंजीनियरिंग के संयोजन ने संरचनात्मक हृदय दोषों की प्रतिकृति और निदान के लिए सीएचडी के पीछे आणविक मार्गों को और स्पष्ट करने की अनुमति दी है। माउस मॉडल में कार्डियक फेनोटाइप्स को स्क्रीन करने के लिए नॉनइनवेसिव भ्रूण इकोकार्डियोग्राफी का उपयोग एपिस्कोपिक फ्लोरेसेंस इमेज कैप्चर (ईएफआईसी) की उच्च निष्ठा के साथ-साथ एपिस्कोपिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (ईसीएम) हिस्टोपैथोलॉजी का उपयोग तीन आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण के साथ विभिन्न जन्मजात हृदय दोषों की शारीरिक रचना में एक विस्तृत दृश्य को सक्षम बनाता है। यह प्रोटोकॉल मुराइन जन्मजात हृदय दोषों का सटीक निदान प्राप्त करने के लिए इन तरीकों के पूर्ण वर्कफ़्लो को रेखांकित करता है। जीवों को मॉडल करने के लिए इस फेनोटाइपिंग प्रोटोकॉल को लागू करने से सटीक सीएचडी निदान की अनुमति मिलेगी, जिससे सीएचडी के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्राप्त होगी। सीएचडी के अंतर्निहित तंत्र की पहचान करना संभावित उपचारों और हस्तक्षेपों के लिए अवसर प्रदान करता है।
Introduction
जन्मजात हृदय रोग (सीएचडी) सबसे आम नवजात जन्म दोष 1,2 हैं, जो लगभग 0.8% -1.7% नवजात शिशुओं को प्रभावित करते हैं और इसके परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण नवजात मृत्यु दर और रुग्णताहोती है। एक आनुवंशिक एटियलजि को सीएचडी 4,5 के साथ दृढ़ता से इंगित किया जाता है। आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल का उपयोग सीएचडी की जटिलता और तंत्र को समझने के लिए व्यापक रूप से किया गया है जो चूहों के चार-कक्ष हृदय और माउस और मानव भ्रूण में तुलनीय कार्डियक विकास डीएनएअनुक्रमों के कारण उनका कारण बनता है। माउस उत्परिवर्ती के फेनोटाइप की पहचान करना लक्षित जीन के कार्य को चिह्नित करने में मौलिक पहला कदम है। जीन खुराक प्रभाव व्यक्त करने वाले माउस मॉडल, जिसमें एक एकल आनुवंशिक उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप हृदय संबंधी दोषों का एक स्पेक्ट्रम हो सकता है जो मानव सीएचडी की नकल करते हैं, सीएचडी की जटिलता और उनके कारण होने वाले तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
यह लेख माउस मॉडल में कार्डियक फेनोटाइप को चिह्नित करने के लिए एक पाइपलाइन की रूपरेखा तैयार करता है। लागू विधियों में भ्रूण इकोकार्डियोग्राम 7 का उपयोग किया जाताहै, इसके बाद नेक्रोपसी और ईसीएम हिस्टोपैथोलॉजी 7,8, जो मुराइन कार्डियक फेनोटाइप ्स के विकास की विस्तृत शारीरिक रचना प्रदर्शित कर सकते हैं। एक भ्रूण इकोकार्डियोग्राम एक गैर-आक्रामक साधन है जो उचित इमेजिंग संकल्प के साथ कई भ्रूणों के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। इसके अलावा, एक भ्रूण इकोकार्डियोग्राम एक कूड़े में भ्रूण की कुल संख्या, उनके विकासशील चरणों और गर्भाशय के सींग में सापेक्ष अभिविन्यास और स्थान का त्वरित निर्धारण प्रदान करता है। रंग प्रवाह का उपयोग करके, असामान्य भ्रूण को संरचना, हेमोडायनामिक गड़बड़ी, विकास प्रतिबंध, या हाइड्रोप्स के विकास के आधार पर पहचाना जा सकता है। चूंकि एक भ्रूण इकोकार्डियोग्राम अध्ययन एक गैर-आक्रामक तकनीक है, इसलिए इसका उपयोग कई दिनों पर स्कैन करने और हेमोडायनामिक्स या कार्डियक आकृति विज्ञान में परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। भ्रूण इकोकार्डियोग्राम की उच्च गुणवत्ता वाली इमेजिंग प्राप्त करने के लिए अभ्यास और कौशल की आवश्यकता होती है, क्योंकि अनुभव और ज्ञान की कमी के कारण विशिष्ट हृदय दोष छूट सकते हैं। इस वजह से, नेक्रोपसी और ईसीएम हिस्टोपैथोलॉजी के संयोजन के माध्यम से कार्डियक आकृति विज्ञान का अधिक निश्चित विश्लेषण प्राप्त किया जा सकता है। नेक्रोपसी आर्क संरचना, महाधमनी और फुफ्फुसीय धमनी के सापेक्ष संबंधों, वेंट्रिकल्स और एट्रिया का आकार, छाती के सापेक्ष हृदय की स्थिति और ब्रोन्कोपुलमोनरी संरचनाओं का प्रत्यक्ष दृश्य प्रदान करता है। हालांकि, आंतरिक विशेषताएं जैसे हृदय वाल्व और दीवार मोटाई अकेले नेक्रोपसी के माध्यम से आकलन करना मुश्किल हो सकता है। इस प्रकार, एक निर्णायक निदान के लिए ईसीएम हिस्टोपैथोलॉजी की सिफारिश की जाती है। ईसीएम हिस्टोपैथोलॉजी एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन विज़ुअलाइज़ेशन तकनीक है जो छवि स्टैक9 के 2 डी और 3 डी पुनर्निर्माण दोनों की अनुमति देती है। ये छवियां एक पैराफिन-एम्बेडेड नमूने के सीरियल एपिस्कोपिक फ्लोरोसेंट इमेजिंग के माध्यम से प्राप्त की जाती हैं क्योंकि इसे स्वचालित माइक्रोटोम द्वारा लगातार अंतराल पर पतला रूप से वर्गीकृत किया जाता है। शास्त्रीय हिस्टोलॉजी के विपरीत, छवियों को ब्लॉक से काटने से पहले एक खंड के रूप में कैप्चर किया जाता है जैसे कि सभी छवियों को एक ही संदर्भ फ्रेम के भीतर कैप्चर किया जाता है। इस वजह से, ईसीएम हिस्टोपैथोलॉजी द्वारा उत्पादित 2 डी छवि स्टैक को आसानी से और मज़बूती से तीन आयामों में पुनर्निर्मित किया जा सकता है। यह एक DICOM दर्शक का उपयोग करके किया जाता है, जो तीन शारीरिक विमानों में छवियों के 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है: कोरोनल, कोरोनल और अनुप्रस्थ। इन उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी पुनर्निर्माण से, एक निश्चित कार्डियक निदान किया जा सकता है। इन तीन अलग-अलग विज़ुअलाइज़ेशन तौर-तरीकों का आवेदन, या तो व्यक्तिगत रूप से या संयोजन में, माउस भ्रूण में संरचनात्मक हृदय दोषों के सटीक लक्षण वर्णन प्रदान कर सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का उपयोग जन्मजात हृदय दोषों के पैथोमैकेनिज्म को समझने के लिए किया गया है। इस अध्ययन में हम जो प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, वे मुराइन भ्रूण हृदय दोषों का आकलन करने की प्रक्र?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कोई नहीं।
Materials
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
Referências
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