Een pijplijn om structurele hartafwijkingen in de foetale muis te karakteriseren
Summary
Dit artikel beschrijft de diagnostische methoden voor congenitale hartziekten (CHD) met behulp van foetale echocardiografie, obductie en episcopische fluorescentiebeeldopname (EFIC) met behulp van episcopische confocale microscopie (ECM) gevolgd door driedimensionale (3D) reconstructie.
Abstract
Aangeboren hartziekten (CHD’s) zijn belangrijke oorzaken van kindersterfte in de Verenigde Staten. In de jaren 1980 en eerder stierven de meeste patiënten met matige of ernstige CHD vóór de volwassenheid, met de maximale mortaliteit tijdens de eerste levensweek. Opmerkelijke vooruitgang in chirurgische technieken, diagnostische benaderingen en medisch management hebben geleid tot duidelijke verbeteringen in de resultaten. Om tegemoet te komen aan de kritische onderzoeksbehoeften van het begrijpen van aangeboren hartafwijkingen, hebben muizenmodellen een ideaal onderzoeksplatform geboden, omdat ze zeer vergelijkbare hartanatomie hebben als mensen en korte zwangerschapspercentages. De combinatie van genetische manipulatie met high-throughput fenotyperingstools heeft de replicatie en diagnose van structurele hartafwijkingen mogelijk gemaakt om de moleculaire routes achter CHD’s verder op te helderen. Het gebruik van niet-invasieve foetale echocardiografie om de cardiale fenotypes in muismodellen te screenen in combinatie met de high fidelity van Episcopic fluorescence image capture (EFIC) met behulp van Episcopische confocale microscopie (ECM) histopathologie met driedimensionale (3D) reconstructies maakt een gedetailleerd inzicht in de anatomie van verschillende aangeboren hartafwijkingen mogelijk. Dit protocol schetst een complete workflow van deze methoden om een nauwkeurige diagnose van muizen aangeboren hartafwijkingen te verkrijgen. Het toepassen van dit fenotyperingsprotocol op modelorganismen zal een nauwkeurige CHD-diagnose mogelijk maken, wat inzicht oplevert in de mechanismen van CHD. Het identificeren van de onderliggende mechanismen van CHD biedt kansen voor potentiële therapieën en interventies.
Introduction
Aangeboren hartziekten (CHD’s) zijn de meest voorkomende neonatale geboorteafwijking 1,2, die ongeveer 0,8% -1,7% van de pasgeborenen treft en resulteert in significante neonatale mortaliteit en morbiditeit3. Een genetische etiologie is sterk geïndiceerd met CHD’s 4,5. Genetisch gemodificeerde muismodellen zijn op grote schaal gebruikt om de complexiteit van CHD’s en de mechanismen die ze veroorzaken te begrijpen als gevolg van het feit dat de muizen harten met vier kamers en vergelijkbare cardiale ontwikkelings-DNA-sequenties hebben bij muizen en menselijke foetussen6. Het identificeren van het fenotype van de muismutanten is de fundamentele eerste stap in het karakteriseren van de functie van het beoogde gen. Muismodellen die gendoseringseffecten tot expressie brengen, waarbij een enkele genetische mutatie kan resulteren in een spectrum van hartafwijkingen die menselijke CHD’s nabootsen, zijn belangrijk voor het begrijpen van de complexiteit van CHD’s en de mechanismen die ze veroorzaken.
Dit artikel schetst een pijplijn om cardiale fenotypen in muismodellen te karakteriseren. De toegepaste methoden maken gebruik van foetaal echocardiogram7, gevolgd door obductie en ECM-histopathologie 7,8, die de gedetailleerde anatomie van het ontwikkelen van muizenhartfenotypen kan weergeven. Een foetaal echocardiogram is een niet-invasieve modaliteit die directe visualisatie van meerdere embryo’s met een redelijke beeldresolutie mogelijk maakt. Bovendien biedt een foetaal echocardiogram een snelle bepaling van het totale aantal embryo’s in een nest, hun ontwikkelingsstadia en de relatieve oriëntatie en locatie in de baarmoederhoorn. Met behulp van een spectrale Doppler/kleurstroom kunnen abnormale embryo’s worden geïdentificeerd op basis van de structuur, de hemodynamische verstoring, de groeibeperking of de ontwikkeling van hydrops. Aangezien een foetaal echocardiogramonderzoek een niet-invasieve techniek is, kan het worden gebruikt om op meerdere dagen te scannen en om de veranderingen in hemodynamiek of cardiale morfologie te observeren. Het verkrijgen van hoogwaardige beeldvorming van foetale echocardiogrammen vereist oefening en vaardigheid, omdat specifieke hartafwijkingen kunnen worden gemist vanwege een gebrek aan ervaring en kennis. Hierdoor kan een meer definitieve analyse van cardiale morfologie worden verkregen door een combinatie van obductie en ECM-histopathologie. Obductie biedt directe visualisatie van de boogstructuur, de relatieve relaties van de aorta en longslagader, de grootte van de ventrikels en boezems, de positie van het hart ten opzichte van de borst en de bronchopulmonale structuren. Interieurkenmerken zoals de hartkleppen en wanddikte kunnen echter moeilijk te beoordelen zijn door obductie alleen. Ecm-histopathologie wordt dus aanbevolen voor een sluitende diagnose. ECM-histopathologie is een visualisatietechniek met hoge resolutie die zowel 2D- als 3D-reconstructie van de beeldstapel9 mogelijk maakt. Deze beelden worden verkregen door middel van seriële episcopische fluorescerende beeldvorming van een paraffine-ingebed monster, omdat het met een consistent interval dun wordt doorsneden door een automatische microtoom. In tegenstelling tot de klassieke histologie worden afbeeldingen vastgelegd als een sectie voordat deze uit het blok wordt gesneden, zodat alle afbeeldingen binnen hetzelfde referentiekader worden vastgelegd. Hierdoor kan de 2D-beeldstapel geproduceerd door ECM histopathologie eenvoudig en betrouwbaar worden gereconstrueerd in drie dimensies. Dit wordt gedaan met behulp van een DICOM-viewer, die 3D-visualisatie van de beelden in de drie anatomische vlakken mogelijk maakt: coronaal, sagittale en transversale. Uit deze hoge resolutie 3D reconstructies kan een definitieve hartdiagnose worden gesteld. De toepassing van deze drie verschillende visualisatiemodaliteiten, individueel of in combinatie, kan nauwkeurige karakteriseringen van structurele hartafwijkingen in muizenembryo’s opleveren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genetisch gemodificeerde muizen zijn gebruikt om de pathomechanismen van aangeboren hartafwijkingen te begrijpen. De protocollen die we in deze studie bieden, proberen het proces van het beoordelen van muizen foetale hartafwijkingen te stroomlijnen en te standaardiseren. Er zijn echter kritieke stappen om op te merken tijdens het protocol. Muizenembryo’s groeien aanzienlijk tijdens elke dag van de dracht en de juiste tijd om een muis te oogsten kan worden bepaald door nauwkeurig een foetaal echocardiogram uit te voeren. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Geen.
Materials
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
Referências
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicina. 99 (23), e20593 (2020).
- vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
- Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
- Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
- Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
- Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
- Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
- Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
- Yu, Q., Tian Leatherbury, ., Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
- Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).
