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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Modélisation du carcinome épidermoïde bucco-œsophagien dans les organoïdes 3D

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64676
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1,3, 1,3, 4, 1,2, 1,5, 1,6, 1,7, 1,5, 1,2,5
1Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, 2Organoid and Cell Culture Core, Columbia University Digestive and Liver Diseases Research Center, Columbia University, 3Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, Columbia University, 4Histopathology Facility, Fox Chase Cancer Center, 5Division of Digestive and Liver Diseases, Department of Medicine, Columbia University, 6Department of Genetics and Development, Columbia University, 7Section of Oral, Diagnostic and Rehabilitation Sciences, College of Dental Medicine, Columbia University
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole décrit les étapes clés pour générer et caractériser les organoïdes 3D murins oraux-œsophagiens qui représentent les lésions de carcinome épidermoïde normal, prénéoplasique et épidermoïde induites par cancérogenèse chimique.

Abstract

Le carcinome épidermoïde de l’œsophage (ESCC) est répandu dans le monde entier, représentant 90% de tous les cas de cancer de l’œsophage chaque année, et est le plus mortel de tous les carcinomes épidermoïdes humains. Malgré les progrès récents dans la définition des changements moléculaires accompagnant l’initiation et le développement de l’ESCC, le pronostic du patient reste sombre. L’annotation fonctionnelle de ces changements moléculaires est la prochaine étape nécessaire et nécessite des modèles qui capturent les caractéristiques moléculaires de l’ESCC et peuvent être manipulés facilement et à peu de frais pour l’annotation fonctionnelle. Les souris traitées avec la fumée de tabac mimétique 4-nitroquinoléine 1-oxyde (4NQO) forment de manière prévisible un ESCC et une prénéoplasie œsophagienne. Il convient de noter que les lésions de 4NQO apparaissent également dans la cavité buccale, le plus souvent dans la langue, ainsi que dans le préestomac, qui partagent tous l’épithélium pavimenteux stratifié. Cependant, ces souris ne peuvent pas être simplement manipulées pour tester des hypothèses fonctionnelles, car la génération de modèles murins isogéniques nécessite beaucoup de temps et de ressources. Ici, nous surmontons cette limitation en générant des organoïdes tridimensionnels (3D) dérivés de cellules uniques à partir de souris traitées avec 4NQO pour caractériser les ESCC murins ou les cellules prénéoplasiques ex vivo. Ces organoïdes capturent les caractéristiques saillantes de l’ESCC et de la prénéoplasie œsophagienne, peuvent être exploités rapidement et à peu de frais pour former des modèles isogéniques et peuvent être utilisés pour des expériences de transplantation syngénique. Nous démontrons comment générer des organoïdes 3D à partir de tissu œsophagien murin normal, prénéoplasique et SCC et maintenir et cryopréserver ces organoïdes. Les applications de ces organoïdes polyvalents sont vastes et comprennent l’utilisation de souris génétiquement modifiées et une caractérisation plus poussée par cytométrie de flux ou immunohistochimie, la génération de lignées organoïdes isogéniques à l’aide des technologies CRISPR et le criblage de médicaments ou la transplantation syngénique. Nous pensons que l’adoption généralisée des techniques démontrées dans ce protocole accélérera les progrès dans ce domaine pour lutter contre le lourd fardeau de la CSC.

Introduction

Le carcinome épidermoïde œsophagien (ESCC) est le plus mortel des carcinomes épidermoïdes humains, en raison de son diagnostic tardif, de sa résistance au traitement et de ses métastases 1,2. L’ESCC provient de l’épithélium pavimenteux stratifié, qui tapisse la surface luminale de l’œsophage. L’épithélium pavimenteux est composé de cellules basales prolifératives et de cellules différenciées dans la couche de cellules suprabasales. Dans des conditions physiologiques, les cellules basales expriment des marqueurs tels que p63, Sox2 et la cytokératine K5 et K14, tandis que les cellules différenciées expriment K4, K13 et IVL. Les cellules basales elles-mêmes sont hétérogènes et comprennent des cellules souches putatives définies par des marqueurs tels que K153 et CD734. En homéostasie, les cellules basales subissent une différenciation terminale post-mitotique au sein de la couche cellulaire suprabasale, tandis que les cellules différenciées migrent et se desquamate dans la lumière pour compléter le renouvellement épithélial. Rappelant leurs cellules d’origine, l’ESCC présente une différenciation des cellules squameuses à des degrés divers. L’ESCC s’accompagne souvent de lésions précurseurs histologiques multifocales, appelées néoplasie intraépithéliale (IEN) ou dysplasie, comprenant des cellules basaloïdes atypiques. En plus des changements épithéliaux, ESCC affiche un remodelage tissulaire dans le compartiment sous-épithélial, où l’activation des fibroblastes associés au cancer (CAF) et le recrutement de cellules immunitaires / inflammatoires ont lieu pour favoriser le microenvironnement favorisant la tumeur.

La pathogenèse de l’ESCC implique des changements génétiques et l’exposition à des facteurs de risque environnementaux. Les lésions génétiques clés comprennent l’inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs TP53 et CDKN2A (p16INK4A) et l’activation des oncogènes CCND1 (cycline D1) et EGFR, qui aboutissent à une altération de la fonction de point de contrôle du cycle cellulaire, à une prolifération aberrante et à la survie sous un stress génotoxique lié à l’exposition à des carcinogènes environnementaux. En effet, les changements génétiques interagissent étroitement avec les facteurs de risque comportementaux et environnementaux, le plus souvent la consommation de tabac et d’alcool. La fumée de tabac contient des cancérogènes pour l’homme tels que l’acétaldéhyde, qui est également le principal métabolite de l’alcool. L’acétaldéhyde induit des adduits à l’ADN et des liaisons croisées interbrins de l’ADN, entraînant des dommages à l’ADN et l’accumulation de mutations de l’ADN et d’instabilité chromosomique. Compte tenu des stimuli mitogènes excessifs et de la prolifération aberrante due à l’activation oncogène, la transformation maligne des cellules épithéliales œsophagiennes est facilitée par des mécanismes permettant de faire face au stress génotoxique, notamment l’activation des antioxydants, l’autophagie et la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT). Fait intéressant, ces fonctions cytoprotectrices sont souvent activées dans les cellules souches cancéreuses ESCC (CSC) qui sont caractérisées par une expression élevée de CD44 (CD44H) et ont les capacités d’initiation tumorale, d’invasion, de métastases et de résistance au traitement 5,6,7.

L’ESCC a été modélisé en culture cellulaire et dans des modèlesde rongeurs 8,9. Au cours des trois dernières décennies, des modèles robustes de souris génétiquement modifiées d’ESCC ont été développés. Il s’agit notamment des souris transgéniques CCND1 et EGFR 10,11 et p53 et p120Ctn knockout 12,13. Cependant, les changements génétiques uniques n’entraînent généralement pas d’apparition rapide de l’ESCC. Ce défi a été surmonté grâce à l’utilisation de cancérogènes œsophagiens qui récapitulent bien les lésions génétiques humaines dans ESCC14. Par exemple, la 4-nitroquinoléine-1-oxyde (4NQO) accélère le développement de l’ESCC chez les souris transgéniques CCND1 15. Au cours des dernières années, les cellules souches épithéliales œsophagiennes présumées, les cellules progénitrices et leurs destins respectifs ont été étudiés dans des modèles murins traçables par lignée cellulaire 3,4. De plus, ces souris traçables de lignée cellulaire ont été utilisées pour explorer les cellules d’origine de l’ESCC et comment ces cellules donnent naissance à des CSC CD44H via l’histologie conventionnelle et la caractérisation moléculaire basée sur l’omique7.

Un domaine émergent lié à ces modèles murins est la nouvelle application de techniques de culture cellulaire pour analyser les cellules vivantes de l’ESCC et des précurseurs dans un système organoïde tridimensionnel (3D) dans lequel l’architecture des tissus d’origine est récapitulée ex vivo 7,8,9. Ces organoïdes 3D sont rapidement développés à partir d’une suspension unicellulaire isolée à partir de tissus murins, y compris les tumeurs primaires et métastatiques (par exemple, les ganglions lymphatiques, les poumons et les lésions hépatiques). Les cellules sont incorporées dans un extrait de membrane basale (EMB) et alimentées avec un milieu de culture cellulaire sans sérum bien défini. Les organoïdes 3D se développent en 7 à 10 jours, et les structures sphériques résultantes se prêtent à la sous-culture, à la cryoconservation et aux tests pour analyser une variété de propriétés et de fonctions cellulaires, y compris les marqueurs CSC, l’EMT, l’autophagie, la prolifération, la différenciation et la mort cellulaire apoptotique.

Ces méthodes peuvent être largement appliquées à des cultures organoïdes 3D établies à partir de n’importe quel tissu épithélial pavimenteux stratifié, tel que la muqueuse de la tête et du cou (cavité buccale, langue, pharynx et larynx) et même le préestomac. La muqueuse de la tête et du cou est contiguë à l’œsophage, et les deux tissus partagent une organisation, une fonction et une susceptibilité tissulaires similaires à la maladie. Le carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HNSCC) et l’ESCC partagent des lésions génétiques et des facteurs de risque environnementaux liés au mode de vie, tels que l’exposition au tabac et à l’alcool. Soulignant cette similitude, les souris traitées avec le 4NQO mimétique de la fumée de tabac développent facilement à la fois HNSCC et ESCC. Compte tenu de la facilité avec laquelle les protocoles décrits ci-dessous peuvent être appliqués à la modélisation HNSCC, nous incluons des instructions spécifiques pour établir des cultures organoïdes 3D à partir de ces lésions.

Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour générer des organoïdes 3D œsophagiens murins (MEO) représentant des lésions normales, prénéoplasiques et ESCC qui se développent chez les souris traitées avec 4NQO. Diverses souches de souris peuvent être utilisées, y compris des souches de laboratoire courantes telles que C57BL / 6 et des dérivés traçables de lignée cellulaire et d’autres dérivés génétiquement modifiés. Nous mettons l’accent sur les étapes clés, y compris l’isolement de l’épithélium œsophagien murin normal ou malade, la préparation de suspensions unicellulaires, la culture et la surveillance des organoïdes 3D en croissance, la sous-culture, la cryoconservation et le traitement pour les analyses ultérieures, y compris la morphologie et d’autres applications.

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Protocol

Les expériences sur les murins ont été planifiées et réalisées conformément à la réglementation et au protocole animal #AABB1502, examinés et approuvés par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Columbia. Les souris ont été hébergées dans une installation de soins aux animaux appropriée qui assure le traitement sans cruauté des souris et fournit des soins vétérinaires appropriés aux souris et une formation en sécurité de laboratoire pour le personnel de laboratoire.

1. Traitement de souris avec 4NQO pour induire des lésions IEN et ESCC œsophagiennes (temps considéré: jusqu’à 28 semaines)

NOTE: Pour générer des MEO représentant des lésions œsophagiennes néoplasiques, les souris sont soumises à une cancérogenèse chimique médiée par le 4NQO, comme décrit précédemment par Tang et al.14. Les MEO normaux/non néoplasiques sont générés à partir de souris non traitées.

  1. Souris
    1. Hébergez quatre à cinq souris par cage et acclimatez-les à l’animalerie pendant au moins 1 semaine avant de commencer une expérience. Pour réduire la possibilité que les troubles liés à l’âge entraînent l’arrêt prématuré de l’expérience complète de 28 semaines, commencez avec des souris âgées de 8 semaines à 16 semaines.
      NOTE: Des souris C57BL / 6 pesant environ 20-30 g ont été utilisées dans ce protocole. Pour des expériences plus courtes, des souris plus âgées peuvent être utilisées. Les souris mâles ou femelles sont acceptables. Les souris témoins (pas de traitement, voir rubrique 1.3.1) doivent être appariées en âge et en sexe.
  2. Préparation de l’eau potable contenant du 4NQO
    1. Préparer 1 mg/mL de solution mère de 4NQO dans de l’éthylène propylène glycol (table des matières). Dissoudre 100 mg de 4NQO dans 100 mL d’éthylène propylène glycol à 99,9 % dans un bécher en verre de 500 mL recouvert d’un film d’étanchéité. Bien mélanger à température ambiante (RT) à l’aide d’un agitateur magnétique à 800 tr/min pendant 30 min. Conserver à 4 °C.
    2. Ajouter 900 mL d’eau désionisée autoclavée à 100 mL de solution mère 4NQO à 1 mg/mL et mélanger par inversion dans une bouteille graduée en plastique de 2 L recouverte d’un film d’étanchéité. Un volume de 1 L de 100 μg/mL de 4NQO dans 10 % d’éthylène propylène glycol servira deux cages à souris équipées d’un flacon de 500 mL.
      ATTENTION: Il est à noter que le 4NQO est un cancérogène chimique synthétique qui peut causer le cancer. Manipulez avec des gants en nitrile et une blouse de laboratoire à manches longues, et portez des chaussures fermées. Envisagez une protection oculaire, une protection faciale et un couvre-chef appropriés. Pour l’élimination des déchets, le 4NQO doit être placé dans un conteneur étiqueté conformément aux directives institutionnelles pour la gestion des déchets dangereux par la santé et la sécurité environnementales.
  3. Traitement par 4NQO et surveillance
    1. Attachez le flacon et administrez 4NQO via l’eau potable ad libitum aux souris pendant 16 semaines. Utilisez 10 % (p/v) de propylène glycol comme véhicule témoin (sans traitement).
      REMARQUE: Des durées plus courtes de traitement par 4NQO peuvent être utilisées pour induire l’IEN.
    2. Remplissez l’eau une fois par semaine.
    3. Pesez chaque souris chaque semaine en la plaçant dans un récipient en plastique sur une balance de laboratoire.
    4. À la fin de la période de traitement 4NQO de 16 semaines, commencez à donner régulièrement de l’eau potable aux souris pendant la période d’observation post-4NQO pendant une période pouvant aller jusqu’à 12 semaines (Figure 1).
    5. Surveillez quotidiennement les souris pour détecter tout signe de détresse (par exemple, mobilité réduite, habitus voûté et comportement renfermé), de dysphagie et de déshydratation. De plus, évaluez les souris chaque semaine pour les changements de poids corporel ou de nourriture et de liquide. Si le poids corporel diminue de plus de 10% par rapport au poids corporel initial, nourrissez les souris avec un complément alimentaire liquide.
      REMARQUE: Une perte de poids corporel réfractaire aux compléments alimentaires liquides peut indiquer un ESCC, et les souris qui perdent plus de 20% de leur poids corporel doivent être euthanasiées. Il est important de noter que les MEO peuvent être générés à partir de souris euthanasiées prématurément. Notez que les souris C57BL/6 sans modifications génétiques ne présentent généralement pas de signes de morbidité ou de lésions visibles des ESCC avant la fin de la période d’observation post-4NQO.
  4. Préparation des animaux
    1. Euthanasier les souris dans une chambre de CO 2 remplie de CO2 à un débit qui déplace 30% à 70% du volume de la chambre par minute. Confirmer la mort par luxation cervicale.
    2. Épinglez les membres et le nez de la souris en décubitus dorsal à la plate-forme de dissection à l’aide d’aiguilles de 21 G.
    3. Désinfectez la surface ventrale de la souris avec de l’éthanol à 70%.
  5. Dissection (temps : 0,5 h)
    1. Ouvrez la peau en pinçant la fourrure abdominale médiane et la peau pour s’assurer qu’elle est libérée des viscères ci-dessous. Utilisez les ciseaux chirurgicaux pour faire une incision médiane crâniocaudienne et ventrale du bas-ventre au menton.
    2. En commençant par l’incision médiane, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire des coupes radiales s’étendant jusqu’aux membres des deux côtés de la souris. Écorcher les lambeaux de peau ouverts.
    3. Pour exposer la trachée cervicale, utilisez les ciseaux à dissection pour diviser les glandes salivaires à la ligne médiane. La trachée se trouve profondément dans les glandes.
    4. Pour exposer la trachée thoracique, retirez le sternum.
      1. Pincez et soulevez doucement le péritoine avec une pince et utilisez des ciseaux pour diviser le péritoine crâniocaudale et latéralement le long de la cage thoracique.
      2. Rétractez doucement le foie de la surface caudale du diaphragme et utilisez des ciseaux pour faire une petite incision dans le diaphragme à l’encoche sternale, en particulier à la surface dorsale du processus xiphoïde. Cela libère le poumon et le cœur de la plèvre viscérale.
      3. Séparez la cage thoracique du contenu thoracique. Insérez des ciseaux dans l’incision du diaphragme et disséquez crânienne jusqu’à la ceinture cervicale. Au cours de cette dissection, adhérer étroitement à la surface dorsale du sternum pour éviter d’endommager les organes inférieurs. Assurez-vous que le plan de dissection est antérieur à la trachée.
      4. Coupez les côtes de chaque côté du sternum à l’aide de ciseaux et retirez le sternum. Assurez-vous que le contenu thoracique est exposé.
    5. Exposez l’œsophage abdominal. Soulevez doucement l’estomac antérieurement en tenant l’antre avec une pince. Disséquer la rate, le pancréas et le mésentère de l’estomac et de l’œsophage avec des ciseaux.
    6. Exposez l’œsophage thoracique (figure 2).
      1. Soulevez doucement la trachée immédiatement caudale au cartilage thyroïdien et disséquez l’œsophage de la face dorsale de la trachée à l’aide de ciseaux d’iris.
      2. Divisez la trachée au niveau du cartilage thyroïdien avec des ciseaux d’iris.
      3. Décollez la trachée du reste de l’œsophage par dissection soigneuse dans le sens caudal.
      4. Enlevez le poumon, le cœur et le thymus en masse avec la trachée. Prenez soin d’éviter d’endommager l’œsophage lors de la dissection et de la division de l’aorte et de la veine cave.
    7. Divisez l’estomac au niveau du pylore avec des ciseaux.
    8. Séparez l’œsophage de la vertèbre en tenant l’antre avec une pince et en disséquant crâniennement.
    9. Divisez l’œsophage au niveau du cartilage thyroïdien et récoltez l’œsophage et l’estomac en masse (Figure 3).
    10. Séparez l’estomac et l’œsophage en divisant l’œsophage au niveau du cardia (figure 4, panneau supérieur, ligne rouge).
    11. Disséquez tout fascia sur la surface externe de l’œsophage. Pour réserver un échantillon pour l’histologie (facultatif), retirez la moitié de l’œsophage et fendez-le longitudinalement avec des ciseaux. Placer le reste de l’œsophage intact dans du PBS froid sur de la glace.
    12. Ouvrez l’estomac le long de la plus grande courbure et lavez suffisamment avec du PBS. Séparez le préestomac et lavez avec du PBS froid. Placez le préestomac dans du PBS froid sur de la glace.
    13. Pour récolter la langue, retirez l’aiguille de 21 G sur le nez et retirez la langue avec une pince à épiler. Coupez la langue le plus longtemps possible. Placez la langue dans du PBS froid sur de la glace.

2. Mise en place d’une culture d’organoïdes de l’œsophage murin (MEO)

REMARQUE: Ce protocole peut également être utilisé pour établir une culture organoïde de la langue murine avec l’ajout d’une étape dans laquelle le tissu de la langue est haché avant la trypsinisation. Voir la note de l’étape 2.2.3.

  1. Préparation des réactifs
    REMARQUE : Une liste des réactifs se trouve dans le Tableau des matériaux. Préparer et entreposer les solutions mères conformément aux instructions du fabricant, sauf indication contraire.
    1. S’assurer que les aliquotes à usage unique de la matrice membranaire basale (BME) utilisées dans ce protocole sont entreposées à −20 °C jusqu’au jour de l’utilisation, sont ensuite décongelées sur de la glace ou à 2-8 °C, et sont conservées sur la glace en tout temps lorsqu’elles ne sont pas utilisées.
    2. Dissoudre 250 mg d’inhibiteur de la trypsine (ITS) du soja dans 1 000 mL de PBS (concentration de 250 mg/mL de stock) et le stériliser par filtre (0,22 μm). Distribuer 50 ml d’aliquotes dans des tubes coniques et conserver jusqu’à 6 mois à 4 °C.
    3. Préparer le milieu organoïde de souris (MOM): Compléter DMEM / F12 avancé avec 1 mM N-acétyl-L-cystéine (NAC), 2% R-Spondin et milieu conditionné Noggin (RN CM), 1x supplément N-2, 1x supplément B-27, 10 mM HEPES, 1x antibiotique-antimycotique, 1x supplément de GlutaMAX et 100 ng / mL de facteur de croissance épidermique de souris (mEGF). Préparer le MOM 500 mL à la fois, le diviser en aliquotes de 50 mL et conserver entre 2 et 8 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à être utilisé. Ajouter 0,5 μg/mL d’amphotéricine B et 10 μM Y-27632 juste avant utilisation.
    4. Préchauffer le MOM, la trypsine à 0,25 % et l’inhibiteur de la trypsine (ITS) de soja à 37 °C dans un bain d’eau ou de billes avant utilisation.
  2. Isolement des kératinocytes du tissu murin disséqué (temps considéré: 2 h)
    1. Transférer le tissu œsophagien dans 500 μL de dispase dans du PBS (2,5-5 unités au total) et incuber dans un thermomélangeur pendant 10 minutes à 37 °C et 800 tr/min.
    2. Transférer le tissu dans une boîte de culture et retirer délicatement la couche musculaire de l’épithélium à l’aide d’une pince (Figure 4).
      NOTE: Cette étape peut également être effectuée par un chercheur expérimenté avant l’incubation avec dispase.
    3. Transférer l’épithélium dans un tube microcentrifuge contenant 500 μL de trypsine à 0,25 % et incuber dans un thermomélangeur pendant 10 min à 37 °C et 800 tr/min.
      REMARQUE: Si le matériau de départ est du tissu de la langue, hacher le tissu avec un scalpel stérile en morceaux plus petits, d’environ 1-2 mm2 , avant d’ajouter la trypsine.
    4. Centrifuger brièvement pendant 5 à 10 s à 2 000 x g pour enduire le tissu. Préparez un tube conique de 50 mL avec une crépine à cellules de 100 μm. Transférer la suspension tissulaire/cellulaire à travers la crépine avec une extrémité de large alésage en utilisant des mouvements circulaires.
    5. Ajouter 3 mL d’ITS à travers la passoire, en utilisant des mouvements circulaires pour se laver.
    6. Frottez la passoire avec la base d’un piston de seringue à tuberculine de 1 ml pour pousser les cellules à travers.
    7. Lavez la passoire avec 3 ml de PBS 3 à 5 fois, en frottant la crépine avec la base de la seringue entre les lavages.
    8. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 10 min à 4 °C pour granuler les cellules.
    9. Retirer le surnageant en laissant 1 mL de solution dans le tube.
    10. Remettez la pastille en suspension dans le 1 mL restant et transférez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 70 μm dans un nouveau tube conique de 50 mL.
    11. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 10 min à 4 °C pour granuler les cellules.
    12. Resuspendre la pastille dans 100 μL de MOM; Ajustez le volume au besoin. Effectuez un comptage automatisé des cellules par exclusion du bleu trypan.
  3. Ensemencement de la suspension cellulaire initiale (temps considéré: <1 h)
    1. Préchauffer une plaque de culture cellulaire de 24 puits dans un incubateur à 37 °C.
    2. Plaquer 5 000 cellules viables dans 75 % (v/v) BME/MOM avec un volume total de 50 μL par puits. Maximisez le nombre de puits plaqués et préparez suffisamment de cellules dans BME pour un puits supplémentaire selon les exemples de calculs ci-dessous.
      REMARQUE : Cryoconserver tout excès de cellules dans le milieu de cryoconservation (10 % de DMSO dans le FBS) à une concentration maximale de 1 x 106 cellules/mL. Conservez les cryovials dans un récipient congelé pendant la nuit à −80 °C. Transférez-les dans de l’azote liquide en phase vapeur pour un stockage à long terme.
    3. Dans un tube à microcentrifugation, préparer d’abord une dilution cellulaire appropriée dans MOM, puis ajouter le BME à l’aide d’une pointe de large alésage juste avant le placage.
    4. À l’aide d’une pointe de forage de 200 μL de largeur, ajouter lentement une gouttelette de 50 μL au centre du puits, en évitant le contact entre la pointe et le fond ou les côtés du puits (figure 5). Veillez à ne pas utiliser trop de force pour expulser le liquide de la pointe, sinon le dôme s’aplatira.
    5. Laisser le BME se solidifier pendant 30 minutes dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2, 95 % d’humidité relative (HR).
    6. Ajouter délicatement 500 μL de MOM par puits, complété par 0,5 μg/mL d’amphotéricine B et 10 μM Y-27632.
      REMARQUE: Ajouter l’amphotéricine à tous les MOM tout au long de la culture primaire initiale. Ajouter Y-27632 uniquement le jour du passage (jour 0) pour tous les passages.
    7. Changez le MOM les jours 3-4, puis tous les 2-3 jours par la suite jusqu’à ce qu’il soit prêt à passer.
    8. Du 7e au 10e jour, imagez les organoïdes et mesurez le taux de formation des organoïdes (OFR) en divisant le nombre d’organoïdes formés par le nombre de cellules initialement ensemencées.
      Exemples de calculs :
      Equation 1
  4. Passage et cryoconservation des organoïdes œsophagiens murins (MEO) (temps considéré: <1,5 h)
    1. Décongeler et garder le BME sur la glace. Préchauffer le MOM, 0,05 % de trypsine et les IST à 37 °C dans un bain d’eau ou de billes avant utilisation. Préchauffer une plaque de culture cellulaire de 24 puits dans un incubateur à 37 °C.
    2. À l’aide d’une pointe de micropipette à large alésage, recueillir les organoïdes dans le dôme BME avec le surnageant. Perturbez le BME en pipetant de haut en bas.
      REMARQUE : Combinez les puits contenant des échantillons identiques dans un seul tube à microcentrifugation.
    3. Centrifuger brièvement pendant 10-15 s à 2 000 x g pour granuler les organoïdes. Retirez et jetez le surnageant.
    4. Délogez délicatement la pastille et remettez la pastille en suspension dans 500 μL de trypsine à 0,05 %.
    5. Incuber le(s) tube(s) dans un thermomélangeur à 37 °C et 800 tr/min pendant 10 min.
    6. Inactiver la trypsine avec 600 μL d’ITS.
    7. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les cellules.
    8. Retirez et jetez le surnageant. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 100 μL de MOM. Effectuez un comptage automatisé des cellules par exclusion du bleu trypan.
      REMARQUE: Le volume peut être ajusté selon les besoins.
    9. Plaquer 2 000 à 5 000 cellules viables dans 75 % (v/v) BME/MOM avec un volume total de 50 μL par puits. Maximiser le nombre de puits plaqués et préparer suffisamment de cellules en BME pour un puits supplémentaire selon les exemples de calculs mentionnés précédemment.
      REMARQUE : Cryoconserver tout excès de cellules dans le milieu de cryoconservation (10 % de DMSO dans le FBS) à une concentration maximale de 1 x 106 cellules/mL. Conservez les cryovials dans un récipient congelé pendant la nuit à −80 °C. Transférez-les dans de l’azote liquide en phase vapeur pour un stockage à long terme.
    10. Dans un tube à microcentrifugation, préparer d’abord une dilution cellulaire appropriée dans MOM, puis ajouter le BME à l’aide d’une pointe de large alésage juste avant le placage.
    11. À l’aide d’une pointe de forage de 200 μL de large, ajouter lentement une gouttelette de 50 μL au centre du puits, en évitant le contact entre la pointe et le fond ou les côtés du puits. Veillez à ne pas utiliser trop de force pour expulser le liquide de la pointe, sinon le dôme s’aplatira.
    12. Incuber la plaque pendant 30 min dans un incubateur à 37 °C, 5% CO 2,95% HR.
    13. Ajouter délicatement 500 μL de MOM par puits complété par 10 μM Y-27632.
      REMARQUE: Ajouter Y-27632 uniquement le jour du passage (jour 0). Il n’est pas nécessaire de l’ajouter lors des changements de support. L’ajout d’amphotéricine B n’est plus nécessaire.
    14. Changez le MOM les jours 3-4, puis tous les 2-3 jours par la suite jusqu’à ce qu’il soit prêt à passer.
    15. Du 7e au 10e jour, imagez les organoïdes et mesurez l’OFR.
  5. Décongélation et récupération des organoïdes œsophagiens murins (MEO) (temps considéré: <1 h)
    1. Décongeler et garder le BME sur la glace. Préchauffer une plaque de culture cellulaire de 24 puits dans un incubateur à 37 °C.
    2. Préparer 10 mL de froid ou RT MOM ou PBS dans un tube conique de 15 mL.
    3. Décongeler un cryovial dans un bain-marie ou un bain de billes à 37 °C pendant environ 30 s à 1 min ou jusqu’à ce qu’il reste un petit granule de glace.
    4. À l’aide d’une pointe de pipette pré-mouillée, transférez lentement la suspension cellulaire dans le tube contenant MOM ou PBS de manière goutte à goutte.
    5. Centrifuger le tube pendant 300 x g et 4 °C pendant 5 min pour granuler les cellules.
    6. Retirez et jetez le surnageant. Resuspendre la pastille de cellule dans 100 μL de MOM; Ajustez le volume au besoin. Effectuez un comptage automatisé des cellules par exclusion du bleu trypan.
    7. Plaque 5 000-10 000 cellules viables dans 75% (v/v) BME/MOM avec un volume total de 50 μL par puits. Maximiser le nombre de puits plaqués et préparer suffisamment de cellules dans BME pour un puits supplémentaire selon les exemples de calculs mentionnés précédemment.
    8. Poursuivre les étapes restantes du protocole de passage et de cryoconservation des organoïdes de l’œsophage murin (MEO) (voir étape 2.4.11).

3. Préparation des organoïdes pour l’incorporation de paraffine (temps considéré: <1 h [plus 1,5 h pour la préparation du réactif])

  1. À l’aide d’une pointe de micropipette de grand calibre, prélever trois puits par tube de microcentrifugeuse. Collectez les organoïdes dans le dôme BME avec le surnageant. Perturbez le BME en pipetant de haut en bas.
  2. Centrifuger brièvement pendant 10-15 s à 2 000 x g pour granuler les organoïdes. Retirez et jetez le surnageant.
  3. Délogez délicatement la pastille et remettez la pastille en suspension dans 300 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %.
  4. Fixer les organoïdes pendant une nuit à 4 °C.
  5. Centrifuger brièvement pendant 10-15 s à 2 000 x g pour granuler les organoïdes. Retirez et jetez autant de PFA que possible.
  6. Délogez délicatement la pastille et remettez la pastille en suspension dans 500 μL de PBS.
    REMARQUE: Les organoïdes fixes peuvent être conservés à 4 ° C jusqu’à 2 semaines avant de passer à l’étape suivante.
  7. Préparez un bouillon de 50 ml de gel d’agar (2 % de gélose plus 2,5 % de gélatine).
    NOTE: Préparez le stock de gel gélose à l’avance, en raison du temps d’incubation, puis effectuez le cycle d’autoclave.
    1. Remettez en suspension 1 g de bacto-agar et 1,25 g de gélatine dans 50 mL d’eau dans un bécher en verre autoclavable de 150 mL.
    2. Faites tourbillonner la suspension et laissez-la reposer pendant 30-60 minutes à RT.
    3. Autoclave de 20 min à 121 °C.
    4. Refroidir légèrement et distribuer 5 mL d’aliquotes dans des tubes coniques de 15 mL.
    5. Conserver jusqu’à 6 mois chez RT.
  8. Préparez une surface d’encastrement en inversant un support de tubes microcentrifugeuses et en recouvrant la surface d’une feuille de film d’étanchéité. Étiquette avec le(s) ID(s) organoïde(s) correspondant(s).
  9. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min pour enduire les organoïdes. Retirez et jetez le surnageant.
  10. Pendant ce temps, liquéfier le gel de gélose en plaçant un tube conique de 15 mL contenant le gel de gélose dans un bécher en verre de 150 mL contenant 100 ml d’eau et en utilisant au micro-ondes sur le réglage de puissance maximale pendant 1-2 minutes ou jusqu’à ce que l’eau commence à bouillir et que le gel de gélose soit à l’état liquide.
    ATTENTION : Desserrez le capuchon du tube conique contenant le gel de gélose avant de passer au micro-ondes.
  11. Immerger partiellement le tube de microcentrifugation contenant la pastille organoïde dans l’eau chaude sans introduire d’eau dans le tube de microcentrifugeuse.
  12. Recouvrir soigneusement la pastille organoïde en ajoutant 50 μL de gélose sur le côté du tube.
  13. Sans déranger la pastille (ne pas remettre en suspension, garder la pastille intacte), transférer la pastille dans la gouttelette de gel gélosé sur le film d’étanchéité sur la surface d’enrobage.
  14. Répétez les étapes 3.12 et 3.13 avec 50 μL supplémentaires de gélose liquide pour recueillir toute pastille organoïde restante et ajoutez-les délicatement à la même gouttelette de gel.
  15. Incuber la gouttelette contenant la pastille organoïde pendant 45 min à 4 °C.
  16. À l’aide d’une pince, transférer délicatement la gouttelette contenant la pastille organoïde dans une cassette de pathologie étiquetée.
  17. Conservez la cassette dans de l’éthanol à 70 % à 4 °C jusqu’à 1 mois.
  18. Procéder à l’incorporation de paraffine via un traitement histologique de routine pour préparer les blocs de paraffine.

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Representative Results

Ce protocole décrit le processus de génération d’organoïdes œsophagiens murins (MEO) à partir de tissu œsophagien normal ou de tissu tumoral ESCC à partir de souris traitées par 4NQO selon un schéma thérapeutique spécifique consistant en 16 semaines de 4NQO administré dans l’eau potable, suivies d’une période d’observation de 10 semaines à 12 semaines (Figure 1). Les souris sont ensuite euthanasiées pour la dissection de la langue ou du tissu œsophagien (Figure 2 et Figure 3). Nous décrivons une méthode pour l’isolement de la couche épithéliale de l’œsophage intact (Figure 4) à utiliser pour l’isolement ultérieur d’une seule cellule. Les cellules épithéliales dérivées de l’œsophage sont initialement plaquées à 5 000 cellules par puits dans des gouttelettes de 50 μL contenant des cellules dans une matrice membranaire basale et un milieu de culture cellulaire sans sérum bien caractérisé (Figure 5) et laissées former des organoïdes au cours de 7 à 10 jours en moyenne. Les organoïdes murins de l’œsophage, de la langue et du préestomac peuvent être caractérisés par analyse morphologique par imagerie à contraste de phase/fond clair et histopathologie (Figure 6). La capacité d’auto-renouvellement des organoïdes peut être évaluée en déterminant l’OFR lors de la sous-culture (Figure 7). L’OFR est largement influencé par le contenu des cellules basaloïdes prolifératives, tel que révélé par l’analyse de la cinétique de croissance couplée à leur morphologie (Figure 8). Enfin, ces organoïdes, y compris les structures normales de souris non traitées au 4NQO, se développent continuellement et peuvent être maintenus pendant une longue période (Figure 9).

Figure 1
Figure 1 : Le schéma thérapeutique 4NQO. Les souris sont traitées avec 4NQO dans l’eau potable pendant 16 semaines, suivies d’une période d’observation de 10 semaines à 12 semaines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Exposition de l’œsophage thoracique. La trachée (lignes bleues) est décollée de l’œsophage (lignes blanches). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Œsophage (lignes blanches) relié à l’estomac (lignes jaunes) à la jonction pavimenteuse (ligne bleue). Abréviations : FS = préestomac, DS = estomac distal, L = foie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Séparation de l’estomac et de l’œsophage et isolement de l’épithélium. Haut : L’estomac est séparé de l’œsophage. La ligne rouge indique où l’œsophage doit être détaché pendant la dissection. Milieu : L’épithélium (ligne blanche) est décollé de la couche musculaire. Inférieur : L’œsophage portant des tumeurs suivant le schéma thérapeutique décrit à la figure 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Placage de la gouttelette BME contenant des cellules simples à l’aide d’une pointe de large alésage. Les organoïdes commencent à se former vers les jours 4-7 et sont prêts à être passés après 7-10 jours en moyenne. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Caractérisation des organoïdes par analyse morphologique.  (A) Images représentatives des OPM normaux et ESCC. En haut à gauche : Image en fond clair d’un MEO normal. En bas à gauche : coloration H&E d’un MEO normal. En haut à droite : Image en fond clair d’un MEO ESCC provenant d’une souris traitée 4NQO. En bas à droite : coloration H&E d’un MEO ESCC d’une souris traitée au 4NQO présentant une atypie nucléaire et une kératinisation abrupte, cette dernière rappelant une perle de kératine, représentant un compartiment bien différencié au sein d’une tumeur SCC.  (B) Images représentatives des organoïdes normaux de la langue et du préestomac de souris (MTO et MFO, respectivement). En haut à gauche : Image en fond clair d’un MTO normal. En bas à gauche : coloration H&E d’un MTO normal. En haut à droite : Image en fond clair d’une MFO normale. En bas à droite : coloration H&E d’une MFO normale. Toutes les barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Détermination de la capacité de renouvellement organoïde. (A) Conception expérimentale pour déterminer la capacité de renouvellement organoïde par sous-culture. Les organoïdes primaires en croissance (P0) sont dissociés à différents moments et transformés en suspensions unicellulaires. Ces cellules sont transmises pour déterminer l’OFR au jour 7 dans la sous-culture (P1). (B) Données représentatives sur les RFO provenant d’OEM transmis et générées à partir de souris non traitées au 4NQO. Notons que l’OFR diminue en fonction du temps, reflétant une diminution des cellules basaloïdes prolifératives dans les organoïdes matures, qui contiennent plus de cellules ayant subi une différenciation terminale post-mitotique (voir Figure 8). p < 0,001 (n = 6) OFR au jour 7, au jour 11 et au jour 21 versus OFR au jour 4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Cinétique de croissance des organoïdes révélée par leur morphologie à différents points temporels. Des images représentatives de fond clair et de coloration H & E d’un MEO normal de souris non traitées 4NQO sont montrées. Notez que la kératinisation du noyau interne des organoïdes devient proéminente au jour 10. Les cellules basaloïdes prolifératives restent dans la couche cellulaire la plus externe même aux points temporels du jour 14 et du jour 21. Pour l’immunohistochimie/immunofluorescence, la kératine accumulée peut provoquer une coloration non spécifique, comme c’est le cas pour les tissus épithéliaux épithéliens épithéliens d’origine, ce qui justifie une optimisation minutieuse des conditions de coloration, des témoins (p. ex. anticorps secondaires seulement) et de l’interprétation des données. Toutes les barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : Courbe de doublement de la population d’un MTO normal représentatif généré à partir de souris non traitées au 4NQO. Ces organoïdes ont déjà été générés, cryoconservés et décongelés pour démontrer leur croissance constante sur de multiples passages et une culture à long terme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Il existe plusieurs étapes et considérations critiques pour la génération et l’analyse des opérateurs en économie de marché dans les protocoles décrits ici. Pour assurer la reproductibilité et la rigueur des expériences MEO, les réplications biologiques et techniques sont toutes deux importantes. Pour les réplications biologiques, deux à trois souris indépendantes portant de l’ESCC sont généralement suffisantes par condition expérimentale. Cependant, le nombre approprié de répétitions biologiques peut varier en fonction des paramètres à tester dans les études individuelles. Par exemple, on ignore actuellement à quel moment et à quelle fréquence les organoïdes néoplasiques peuvent être détectés chez des souris traitées au 4NQO sans lésions macroscopiquement visibles ou lésions histologiques IEN et ESCC. Bien que le 4NQO induise des lésions œsophagiennes dans diverses souches de souris14, les MEO ont été générés à partir de souris C57BL/6 uniquement. Le développement et la progression de l’ESCC sont accélérés chez les souris présentant des lésions génétiques génétiquement modifiées telles que la perte de Trp53 et la surexpression de la cycline D1 7,14,15. Chez ces souris, les MEO néoplasiques peuvent apparaître plus fréquemment et plus tôt que chez les souris C57BL/6 de type sauvage pendant ou après le traitement par 4NQO. Si nécessaire, des études pilotes devraient être effectuées pour estimer la taille appropriée de l’échantillon de souris dans les expériences prévues. Avec les plaques de culture cellulaire multi-puits, des répliques techniques (n = 3-6) sont facilement créées. Cependant, un pipetage et une pratique prudents sont justifiés pour minimiser la variabilité du puits au puits car les cellules sont distribuées dans un milieu visqueux contenant des EMB.

On peut s’attendre à un taux de réussite proche de 100% pour l’établissement d’un opérateur en économie de marché dans les protocoles décrits. Cependant, le succès de la culture MEO dépend de la viabilité des cellules épithéliales œsophagiennes isolées initiales, ce qui est largement lié à la qualité du matériau de départ. Lorsque les souris ne peuvent pas être disséquées immédiatement après l’euthanasie, les carcasses peuvent être conservées à 4 °C pendant la nuit pour isoler les œsophages le lendemain. Cependant, les carcasses ne doivent pas être congelées, car les tissus congelés ne produiront pas de cellules viables. Les cellules épithéliales œsophagiennes dissociées peuvent être cryoconservées sous forme de suspension unicellulaire dans un milieu de congélation (90% FBS et 10% DMSO) et stockées dans de l’azote liquide pour générer des organoïdes à une date ultérieure. Les œsophages (feuillets épithéliaux) peuvent être cryoconservés de la même manière, mais de manière moins optimale. Alors que les MEO peuvent être initiées avec des cellules purifiées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et d’autres méthodes pour purifier des sous-ensembles uniques de cellules épithéliales œsophagiennes, la viabilité cellulaire peut être diminuée après la purification. Il convient de noter que les tests de viabilité cellulaire tels que le test d’exclusion du bleu de trypan peuvent distinguer les cellules vivantes des cellules mortes, mais pas les cellules mourantes, sous-estimant ainsi la viabilité cellulaire avant le début de la culture organoïde. Après l’établissement, les MEO des souris traitées et non traitées au 4NQO peuvent être passés indéfiniment (>20 passages), avec une viabilité de >80% attendue à chaque passage dans le milieu spécifié. Il convient de noter qu’il existe des composants de milieu organoïde dont les exigences restent floues. Zheng et al. ont récemment démontré qu’un supplément comprenant Wnt3A, RSpondin-1 et Noggin est nécessaire pour cultiver des organoïdes œsophagiens murins16. Cependant, nous n’utilisons pas Wnt3A dans ce protocole car les organoïdes de la langue, de l’œsophage et du préestomac se développent et peuvent être passés plusieurs fois (>10 passages) sans lui 7,3,17. Il convient de noter que les exigences de ces facteurs n’ont pas été testées individuellement.

Les feuilles épithéliales sont utilisées pour générer des MEO à partir de l’œsophage normal ou de la muqueuse œsophagienne sans lésions macroscopiquement visibles telles que des tumeurs. L’utilisation de feuilles épithéliales permet l’enrichissement des cellules épithéliales comme matière première. Cependant, l’isolement des feuilles épithéliales de la muqueuse œsophagienne porteuse de tumeur est difficile en raison de l’invasion de l’ESCC dans les compartiments sous-épithéliaux. L’œsophage entier peut être utilisé pour initier la culture MEO, bien que la présence de populations de cellules non épithéliales puisse diminuer le taux de formation organoïde (OFR) dans la culture initiale. On s’attend à ce que l’OFR augmente dans les passages suivants, car les conditions actuelles de culture MEO permettent aux cellules épithéliales de se développer dans le BME. Il convient de noter que les protocoles décrits ici peuvent également être appliqués à d’autres organes, en particulier la langue buccale et le préestomac, qui sont tous deux sensibles à la cancérogenèse des cellules squameuses induite par le 4NQO. Il convient de noter que nous avons généré des organoïdes de la langue de souris (MTO) et des organoïdes du préestomac de souris (MFO) à partir des tissus entiers sans isoler les cellules épithéliales. Si nécessaire, ces organoïdes peuvent être fabriqués à partir d’une sous-population de cellules épithéliales purifiées par tri cellulaire activé par fluorescence (p. ex. cellules souches cancéreuses caractérisées par une expression élevée de CD44, cellules souches œsophagiennes présumées CD73+).

De plus, les cellules non épithéliales, les fibroblastes en particulier, peuvent migrer hors de l’EMB pour se développer en monocouche sur la surface du plastique, permettant ainsi l’établissement simultané de fibroblastes œsophagiens murins, y compris les fibroblastes associés au cancer. La sélectivité pour la croissance des cellules épithéliales dans le BME 3D peut limiter la co-culture des MEO avec les cellules immunitaires et d’autres types de cellules dans les conditions actuelles décrites ici. L’optimisation des expériences de co-culture est en cours. De plus, le front invasif tumoral peut être mieux récapitulé dans l’interface épithéliale-stromale modélisée par d’autres méthodes de culture 3D telles que la culture 3D organotypique 8,18. De plus, les MEO peuvent ne pas être une plate-forme appropriée pour mesurer la fonction de barrière épithéliale, qui peut être mieux évaluée en utilisant la culture d’interface air-liquide pour évaluer la résistance électrique transépithéliale 19,20,21.

Le principal avantage des MEO, et même des MTO et des MFO, est la croissance rapide de structures dérivées de cellules uniques qui récapitulent les structures épithéliales d’origine, à la fois bénignes et malignes. Le temps de doublement (DT) de ces organoïdes est généralement estimé à <20 h. La cinétique de croissance des MTO normaux de souris non traitées au 4NQO illustre à la fois la capacité de culture à long terme d’organoïdes normaux, ainsi que le niveau attendu de doublement de la population () et DT (Figure 9). Dans cet exemple, environ 10 doublements de population se sont produits au cours de chaque passage, avec une DT calculée de 18,5 h et 18,3 h, en moyenne. Après la culture primaire initiale, on s’attend généralement à un RFO de 15 % à 25 %, quelle que soit la densité de semis, et les MEO peuvent émerger dès le jour 4 (figure 8), bien qu’elles puissent être de plus petite taille. Sous microscopie à contraste de phase, les organoïdes de la muqueuse œsophagienne normale présentent des structures sphériques avec des surfaces lisses. En fonction du temps, les organoïdes normaux présentent une structure concentrique lorsque la masse cellulaire interne subit une différenciation terminale post-mitotique, générant un gradient de différenciation qui imite l’épithélium pavimenteux stratifié. Les organoïdes néoplasiques présentent des surfaces irrégulières, reflétant la forte activité proliférative des cellules basaloïdes, qui peuvent se développer vers l’extérieur. La capacité des MEO à afficher un gradient de prolifération-différenciation peut être utilisée pour étudier comment les kératinocytes basaux de l’œsophage prolifératifs peuvent se propager et subir une différenciation terminale post-mitotique. En sous-cultivant des cellules MEO dissociées, on peut évaluer l’auto-renouvellement des cellules épithéliales (Figure 7), ainsi que la régénération ou la transformation sous stress génotoxique induit par le 4NQO. Des études similaires peuvent également être menées en utilisant le modèle MTO dans le contexte du cancer de la bouche, élargissant l’application du modèle organoïde de souris 4NQO décrit au CSC de la tête et du cou. Bien que le renouvellement épithélial puisse impliquer des cellules souches, une faiblesse potentielle du système MEO est qu’il peut ne pas détecter les cellules souches quiescentes ou rarement divisées, car la formation de MEO dépend de la prolifération cellulaire. Une étude récente d’analyse unicellulaire sur les MEO a fourni des informations substantielles sur l’hétérogénéité des cellules épithéliales de l’œsophage22.

La transformation maligne peut être évaluée par l’évaluation morphologique minutieuse des structures individuelles des MEO et de l’atypie nucléaire des cellules comprenant les MEO. Le profilage moléculaire des MEO par séquençage de l’exome entier et séquençage de l’ARN peut révéler la nature distincte des lésions prénéoplasiques et ESCC. Cependant, le test ultime de transformation maligne peut nécessiter la transplantation de MEO chez des souris immunodéficientes ou immunocompétentes pour documenter la tumorigénicité des cellules ESCC. Les MEO ESCC transplantés chez des souris immunocompétentes syngéniques peuvent également fournir une excellente plate-forme pour étudier le microenvironnement immunitaire tumoral.

Les applications des opérateurs en économie de marché sont larges. Outre la morphologie, la biochimie et les approches multi-omiques, la cytométrie en flux peut être utilisée non seulement pour analyser des processus cellulaires tels que la synthèse de l’ADN, l’apoptose, l’autophagie et la respiration mitochondriale, mais aussi des marqueurs de surface cellulaire qui définissent des sous-ensembles uniques de cellules dans les MEO correspondant à des modifications génétiques et pharmacologiques ex vivo 7,23 . De plus, les organoïdes peuvent être utilisés pour des expériences de co-culture afin d’évaluer les interactions entre les cellules épithéliales et le stroma, les cellules immunitaires, ou même le microbiome24. Enfin, les MEO peuvent être générées à partir de souris porteuses de modifications génétiques traçables par lignée cellulaire, telles que la protéine rapporteur fluorescente exprimée sous un promoteur de régulation du gène spécifique au type cellulaire (par exemple, Sox2, cytokératines Krt5 et Krt15)3,4,7,25.

En résumé, les MEO sont un outil précieux pour l’étude de l’ESCC. Les protocoles décrits ici visent à montrer que les MEO représentent un modèle polyvalent qui est relativement facile à générer, à maintenir et à caractériser et qui a la capacité de récapituler les caractéristiques de l’ESCC et de la néoplasie œsophagienne.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous remercions les ressources partagées (cytométrie en flux, pathologie moléculaire et microscopie confocale et spécialisée) du Herbert Irving Comprehensive Cancer Center de l’Université Columbia pour leur soutien technique. Nous remercions les Drs Alan Diehl, Adam J. Bass et Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mechanisms of Esophageal Carcinogenesis) et les membres des laboratoires Rustgi et Nakagawa pour leurs discussions utiles. Cette étude a été soutenue par les subventions NIH suivantes: P01CA098101 (H.N. et A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02

(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. et H.N.) et P30CA013696 (A.K.R.). H.N. et C.L. sont récipiendaires du prix pilote multi-IP du Herbert Irving Comprehensive Cancer Center de l’Université Columbia. H.N. est récipiendaire du prix Fanconi Anemia Research Fund. F.M.H. est récipiendaire du prix de la Fondation Mark pour la recherche sur le cancer (20-60-51-MOME) et d’un prix de l’American Association for Cancer Research. J.G. est le récipiendaire du prix de l’American Gastroenterological Association (AGA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25-300-120
0.25% trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25-200-114
0.4% Trypan Blue Thermo Fisher Scientific T10282
1 mL tuberculin syringe without needle BD 309659
1.5 mL microcentrifuge tube Thermo Fisher Scientific 05-408-129
100 µm cell strainer Thermo Fisher Scientific 22363549
15 mL conical tubes Thermo Fisher Scientific 14-959-53A
200 µL wide bore micropipette tips Thermo Fisher Scientific 212361A
21 G needles BD 305167
24 well plate Thermo Fisher Scientific 12-556-006
4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) Tokyo Chemical Industry NO250
50 mL conical tubes Thermo Fisher Scientific 12-565-270
6 well plate Thermo Fisher Scientific 12556004
70 µm cell strainer Thermo Fisher Scientific 22363548
99.9% ethylene propylene glycol SK picglobal
Advanced DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 12634028
Amphotericin B Gibco, Thermo Fisher Scientific 15290018 Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240062 Stock concentration 100x, final concentration 1x
B-27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044 Stock concentration 50x, final concentration 1x
Bacto agar BD 214010
CO2 incubator, e.g.Heracell 150i Thermo Fisher Scientific 51026406 or equivalent
Countess II FL Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000 or equivalent
Cryovials Thermo Fisher Scientific 03-337-7D
DietGel 76A Clear H2O 72-07-5022
Dimethyl sulfoxide (DMSO) MilliporeSigma D4540
Dispase Corning 354235 Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL
Dissecting scissors VWR 25870-002
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 14190250 Stock concentration 1x
Fetal bovine serum (FBS) HyClone SH30071.03
Forceps VWR 82027-386
Freezing container Corning 432002 or equivalent
Gelatin Thermo Fisher Scientific G7-500
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Stock concentration 100x, final concentration 1x
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630080 Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM
Hot plate/stirrer Corning PC-420D or equivalent
Lab Armor bead bath (or water bath) VWR 89409-222 or equivalent
Laboratory balance Ohaus 71142841 or equivalent
Matrigel basement membrane extract (BME) Corning 354234
Microcentrifuge Minispin Eppendorf 22620100 or equivalent
Microcentrifuge tube rack Southern Labware 0061
N-2 supplement Thermo Fisher Scientific 17502048 Stock concentration 100x, final concentration 1x
N-acetylcysteine (NAC) Sigma-Aldrich A9165 Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM
Parafilm M wrap Thermo Fisher Scientific S37440
Paraformaldehyde (PFA) MilliporeSigma 158127-500G
Pathology cassette Thermo Fisher Scientific 22-272416
Phase-contrast microscope Nikon or equivalent
Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) Peprotech 315-09-1mg Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL
RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) N/A N/A Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2%
Sorval ST 16R centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004380 or equivalent
Soybean trypsin inhibitor (STI) MilliporeSigma T9128 Stock concentration 250 µg/mL
ThermoMixer C Thermo Fisher Scientific 14-285-562 PM or equivalent
Y-27632 Selleck Chemicals S1049 Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. Esophageal carcinoma. The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).
  2. Dotto, G. P., Rustgi, A. K. Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics. Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).
  3. Giroux, V., et al. Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).
  4. DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).
  5. Kinugasa, H., et al. Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression. Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).
  6. Whelan, K. A., et al. Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance. Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).
  7. Natsuizaka, M., et al. Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma. Nature Communications. 8 (1), 1758 (2017).
  8. Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).
  9. Sachdeva, U. M., et al. Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids. Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).
  10. Nakagawa, H., et al. The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach. Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).
  11. Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).
  12. Opitz, O. G., et al. A mouse model of human oral-esophageal cancer. The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).
  13. Stairs, D. B., et al. Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene. Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).
  14. Tang, X. -H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).
  15. Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis. Cancer Research. 63 (14), 4244-4252 (2003).
  16. Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
  17. Hisha, H., et al. Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells. Scientific Reports. 3, 3224 (2013).
  18. Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
  19. Nguyen, N., et al. TGF-β1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).
  20. Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).
  21. Ruffner, M. A., et al. Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity. Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).
  22. Kabir, M. F., et al. Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
  23. Shimonosono, M., et al. Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy. Biomolecules. 11 (10), 1479 (2021).
  24. Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. 3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers. Microorganisms. 9 (11), 2182 (2021).
  25. Liu, K., et al. Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).

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Recherche sur le cancer numéro 190
Modélisation du carcinome épidermoïde bucco-œsophagien dans les organoïdes 3D
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