Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Mikrodissektion og helmonteret scanningelektronmikroskopi visualisering af musechoroid plexus

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64733
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1VIB Center for Inflammation Research, VIB, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University
* These authors contributed equally

Summary

Choroid plexus (CP), et understuderet væv i neurovidenskab, spiller en nøglerolle i sundhed og sygdom i centralnervesystemet. Denne protokol beskriver en mikrodissektionsteknik til isolering af CP og brugen af scanningelektronmikroskopi for at få et samlet overblik over dets cellulære struktur.

Abstract

Choroid plexus (CP), en stærkt vaskulariseret struktur, der stikker ud i hjernens ventrikler, er et af de mest understuderede væv inden for neurovidenskab. Da det bliver mere og mere klart, at denne lille struktur spiller en afgørende rolle i sundhed og sygdom i centralnervesystemet (CNS), er det yderst vigtigt at dissekere CP korrekt ud af hjernens ventrikler på en måde, der tillader nedstrøms behandling, lige fra funktionel til strukturel analyse. Her beskrives isolering af lateral og fjerde hjerneventrikelmus CP uden behov for specialværktøj eller udstyr. Denne isolationsteknik bevarer levedygtigheden, funktionen og strukturen af celler inden for CP. På grund af sin høje vaskularisering kan CP visualiseres flydende inde i hjernens ventrikulære hulrum ved hjælp af et kikkertmikroskop. Imidlertid kan transkardieperfusion, der kræves til downstream-analyse, komplicere identifikationen af CP-vævet. Afhængigt af de videre behandlingstrin (f.eks. RNA- og proteinanalyse) kan dette løses ved at visualisere CP via transkardial perfusion med bromphenolblåt. Efter isolering kan CP behandles ved hjælp af flere teknikker, herunder RNA, protein eller enkeltcelleanalyse, for at få yderligere forståelse for funktionen af denne specielle hjernestruktur. Her bruges scanningelektronmikroskopi (SEM) på helmonteret CP til at få et samlet overblik over strukturen.

Introduction

Stramme barrierer adskiller centralnervesystemet (CNS) fra periferien, herunder blod-hjerne-barrieren (BBB) og blod-cerebrospinalvæsken (CSF) barrieren. Disse barrierer beskytter CNS mod eksterne fornærmelser og sikrer et afbalanceret og kontrolleret mikromiljø 1,2,3. Mens BBB er blevet grundigt undersøgt over tid, har blod-CSF-barrieren placeret ved choroid plexus (CP) kun fået stigende forskningsinteresse i løbet af det sidste årti. Denne sidstnævnte barriere kan findes i hjernens fire ventrikler (figur 1A, B) og er kendetegnet ved et enkelt lag af choroid plexus epitelceller (CPE), der omgiver en central stroma, utætte kapillærer, fibroblaster og en lymfoid og myeloid cellepopulation (figur 1C) 4,5,6. CPE-cellerne er tæt forbundet med hinanden ved tætte kryds, hvilket forhindrer lækage fra de underliggende fenestrerede blodkapillærer ind i CSF og hjernen. Derudover reguleres transport på tværs af CPE-cellerne af en række ind- og udadgående transportsystemer, der styrer tilstrømningen af gavnlige forbindelser (f.eks. næringsstoffer og hormoner) fra blodet til CSF og udstrømningen af skadelige molekyler (f.eks. metabolisk affald, overskydende neurotransmittere) i den anden retning 1,6. For at kunne udøve deres aktive transportfunktion indeholder CPE-cellerne adskillige mitokondrier i deres cytoplasma7. Desuden er CP den vigtigste kilde til CSF og fungerer som hjernens gatekeeper ved tilstedeværelsen af residente inflammatoriske celler1. På grund af sin unikke placering mellem blodet og hjernen er CP også perfekt placeret til at udføre immunovervågning8.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over placeringen og sammensætningen af choroid plexus (CP). (A, B) CP-væv findes i de to laterale, den tredje og den fjerde ventrikel i (A) menneskelige og (B) musehjerner. (C) CP-vævet består af et enkelt lag af tæt forbundne kuboide CP-epitelceller (CPE), der omgiver fenestrerede kapillærer, løst bindevæv og lymfoide og myeloide celler og danner blod-cerebrospinalvæskebarrieren (tilpasset og modificeret fra reference23). Figur oprettet med Biorender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

I løbet af det sidste årti har stigende beviser, herunder flere rapporter fra vores forskningsgruppe, afsløret, at CP spiller en central rolle i sundhed og sygdom 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . For eksempel er det kendt, at den aldrende blod-CSF-barriere viser morfologiske ændringer i blandt andet kernerne, mikrovilli og kældermembranen 1,19. Derudover er den overordnede barriereintegritet kompromitteret i forbindelse med Alzheimers sygdom, og alle disse aldersrelaterede ændringer synes at være endnu mere udtalte 1,8,20. Ud over morfologiske ændringer ændres CP's transkriptom, proteom og sekretom under sygdom 12,21,22,23. Således er avanceret viden om CP afgørende for bedre at forstå dens rolle i neurologiske sygdomme og potentielt udvikle nye terapeutiske strategier.

En effektiv metode til nøjagtig mikrodissektion af CP ud af hjernens ventrikler er det første uvurderlige skridt til at muliggøre korrekt undersøgelse af denne lille hjernestruktur. På grund af sin stærkt vaskulariserede natur (figur 2B) kan CP, der flyder inde i hjernens ventrikulære hulrum, identificeres ved hjælp af et kikkertmikroskop. Imidlertid kræves transkardieperfusion ofte til downstream-analyse, hvilket komplicerer korrekt identifikation og isolering af CP-vævet (figur 2C). Hvis de videre behandlingstrin tillader det (f.eks. i tilfælde af RNA- og proteinanalyse), kan CP visualiseres via transkardieperfusion med bromphenolblåt (figur 2A). Flere publikationer beskriver allerede isolationen af CP fra rotte24 og musehvalpehjerner25. Her beskrives en mikrodissektionsisoleringsteknik til isolering af CP fra voksne mus. Det er vigtigt, at denne isolationsteknik bevarer levedygtigheden, funktionen og strukturen af cellerne i CP. Isoleringen af CP, der flyder i fjerde og laterale ventrikler, er beskrevet her. Kort sagt bedøves musene terminalt og om nødvendigt transkardialt perfuserede. Det skal dog bemærkes, at perfusion kan beskadige strukturen af cellerne i CP. Hvis prøven skal analyseres ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM), seriel blokfladescanningelektronmikroskopi (SBF-SEM) eller fokuseret ionstråle SEM (FIB-SEM), bør perfusion derfor ikke udføres. Dernæst isoleres hele hjernen, og tang bruges til sagittalt hemisect hjernen. Herfra kan CP'erne, der flyder i laterale ventrikler, identificeres og dissekeres, mens CP fra fjerde ventrikel kan isoleres fra den cerebellære side af hjernen.

Figure 2
Figur 2: Visualisering af (A-C) fjerde og (D-F) lateral ventrikel choroid plexus (CP) efter (A,D) bromphenolblå perfusion, (B,E) ingen perfusion og (C,F) perfusion med PBS/heparin. Billederne er taget med et stereomikroskop (8x-32x forstørrelse). Klik her for at se en større version af denne figur.

Når CP er korrekt dissekeret ud af hjernens ventrikler, kan et helt repertoire af teknikker anvendes til at få yderligere forståelse for funktionen af denne struktur. For eksempel kan flowcytometri eller enkeltcelle RNA-sekventering udføres for at kvantificere og fænotypisk analysere de infiltrerende inflammatoriske celler under visse sygdomstilstande26,27. Ud over den cellulære sammensætning kan den molekylære sammensætning af CP analyseres for at vurdere tilstedeværelsen af cytokiner og kemokiner via enzymbundet immunosorbentassay (ELISA), immunoblot eller gennem samtidig analyse af flere cytokiner ved anvendelse af cytokinperlearrayet28. Desuden kan transkriptom-, vaskulær-, immuncellehistologi og sekretomanalyser udføres på de mikrodissekerede CP-eksplanter29. Her bruges scanningelektronmikroskopi (SEM) på helmonteret CP til at få et samlet overblik over CP-strukturen. SEM bruger en stråle af fokuserede elektroner til at scanne over overfladen og skabe et billede af overfladens topografi og sammensætning. Da elektronernes bølgelængde er meget mindre end lysets, er opløsningen af SEM i nanometerområdet og bedre end et lysmikroskop. Derfor kan morfologiske undersøgelser på det subcellulære niveau udføres via SEM. Kort fortalt overføres den dissekerede CP straks til et glutaraldehydholdigt fikseringsmiddel til en fiksering natten over efterfulgt af osmication og uranylacetatfarvning. Prøverne behandles derefter med blyaspartatplet, dehydreres og i sidste ende indlejres til billeddannelse.

Således letter denne protokol den effektive isolering af CP fra musehjerneventriklerne, som kan analyseres yderligere ved hjælp af en række nedstrømsteknikker til at undersøge dens struktur og funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg beskrevet i denne undersøgelse blev udført i henhold til den nationale (belgisk lov 14/08/1986 og 22/12/2003, belgisk kongeligt dekret 06/04/2010) og europæisk lovgivning (EU-direktiver 2010/63 / EU, 86/609 / EØF). Alle forsøg på mus og dyreprotokoller blev godkendt af den etiske komité ved Gent Universitet (tilladelsesnumre LA1400091 og EF 2017-026).

1. Forberedelse

  1. Anæstetika: Forbered en terminal bedøvelse. For eksempel kan der fremstilles en natriumpentobarbitalopløsning (≥100 mg/kg) i fosfatbufret saltvand (PBS).
  2. Transkardial perfusionsopløsning: Forbered 10 ml (pr. mus) PBS/heparinopløsning (indeholdende 0,2% heparin) opløsning suppleret med 0,5% bromphenolblåt.
    BEMÆRK: Hvis nedstrøms behandlingstrinnene tillader det (f.eks. i tilfælde af RNA- og proteinanalyse), kan choroid plexus (CP) visualiseres via transkardial perfusion med bromphenolblåt. Hvis bromphenolblåt ikke er kompatibelt med de videre behandlingstrin (f.eks. til billeddannelse), skal du bruge PBS / heparin til perfusering.
  3. Forbered de nødvendige løsninger til SEM-analyse.
    1. Forbered 0,1 M Na-cacodylatbuffer (pH 7,4). Forbered en opløsning af 2% paraformaldehyd og 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M Na-cacodylatbuffer. Der fremstilles 20 ml af denne opløsning pr. prøve.
    2. Forbered 2% osmiumtetroxid i 0,1 M Na-cacodylatbuffer (5 ml pr. Prøve).
    3. Forbered 50%, 70%, 85% og 100% EtOH løsninger. Der fremstilles 5 ml af hver EtOH-opløsning pr. prøve.

2. Mikrodissektion af choroid plexus ud af lateral og fjerde ventrikel

BEMÆRK: Hunmus, 9 uger gamle C57BL/6-mus blev anvendt i denne undersøgelse. Den beskrevne isolationsteknik er imidlertid uafhængig af stammen, kønnet og alderen på den voksne mus.

  1. Isoler musens hjerne.
    1. Intraperitonealt injiceres en dødelig dosis af et kortvirkende barbiturat (>100 mg/kg, fremstillet i trin 1.1) ved hjælp af en 26G nål til terminalbedøvelse af musen. Kontroller musens fodrefleks ved at klemme dens bagpote med tang.
    2. Når der ikke er nogen fodrefleks, skal du placere det terminalt bedøvede dyr i dorsal decubitusposition og fastgøre musen ved at fastgøre lemmerne på en plade.
      BEMÆRK: Hvis transkardieperfusion af musene ikke er nødvendig, afhængigt af downstream-analysemetoden (f.eks. til SEM-billeddannelse), fortsæt til trin 2.1.7. Men hvis perfusion er nødvendig for at fjerne blodlegemer eller andre komponenter i blodet, kan CP visualiseres som en blå struktur, der flyder i hjernens ventrikler via perfusion med bromphenolblå.
    3. Desinficer brystet ved at sprøjte 70% ethanol. Placer et sterilt drapering omkring det kirurgiske område. Lav et snit på ~ 4 cm lige under membranen ved hjælp af et kirurgisk blad i kulstofstål (se materialetabel).
    4. Åbn huden og udsæt brystet ved hjælp af kirurgisk saks. Skær membranen helt åben.
    5. Adskil brystkassen for at udsætte lungerne og det bankende hjerte.
    6. Transkardielt perfusere musene med 10 ml perfusionsopløsning med en hastighed på 4,5 ml / min ved hjælp af en perfusionspumpe (se materialetabel). Perfusionen tager ~ 2 min. Indsæt en 26G nål i venstre ventrikel for at pumpe opløsningen ind i det systemiske kredsløb. Derudover skal du klippe med kirurgisk saks i højre atrium, så blodet kan gå ud af cirkulationen.
      BEMÆRK: En perfusionspumpe foretrækkes frem for manuel administration af væsken, da den leverer væskerne med en præcist programmeret hastighed og sikrer, at forskydningskræfterne forårsaget af perfusionen ikke er for stærke. Overdreven forskydningskræfter vil kompromittere levedygtigheden og strukturen af celler i CP. Derudover er den perfusionsstrømningshastighed, der anbefales her, optimal til perfusering af voksne mus fra 7 uger og fremefter. Hvis der anvendes yngre mus, skal der anvendes en lavere strømningshastighed. Det er også vigtigt at duppe væk blodet, der kommer ud af højre atrium for at bevare et rent kirurgisk sted.
    7. Halshug musen.
      BEMÆRK: Vær forsigtig med at skære hovedet så lavt som muligt til skulderen for at bevare hjernestrukturen. Hvis snittet er for højt, kan cerebellum blive beskadiget.
    8. Efter halshugning skal du skære hovedbunden op ved at lave et snit fra mellem ørerne til bedre end øjnene. Træk huden sideværts for at udsætte kraniet. Skær derefter kraniet op ved at følge squamosal suturer mod næsedelen.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at forsigtigt fjerne kraniet for at opretholde hjernens integritet.
    9. Placer hjernen i en iskold petriskål og tilsæt 1 ml iskold 1x PBS på hjernevævet.
      BEMÆRK: Belægning af skålen er ikke nødvendig.
  2. Isoler CP, der flyder i fjerde ventrikel.
    1. Afskær forsigtigt cerebellum fra cerebrum med en skalpel. Hjernen er den største del af hjernen, mens lillehjernen er en meget mindre del bagerst i hjernen. Fjern om nødvendigt resterende hjernestammevævsdele fra lillehjernen.
    2. Drej hjernen, så skærelinjen vender opad. Sørg for, at det fjerde ventrikelhulrum nu er synligt midt i sektionen, med CP flydende på dorsalstedet. Åbn om nødvendigt ventriklen lidt ved at trække bindevævet op med skarpe tang. På denne måde bliver CP mere synlig og lettere at nå.
    3. Riv forsigtigt CP ud af ventrikelvæggen ved hjælp af små skarpe tang.
      BEMÆRK: Det er vigtigt kun at røre ved og tage CP'en ud i dette trin for ikke at forurene prøven med det omgivende væv. Åbning af ventriklerne som beskrevet i trin 2.2.2 vil lette trin 2.2.3.
  3. Isoler CP, der stikker ud af den laterale ventrikel.
    1. Brug små skarpe tang til sagittalt at skære hjernen i to halvkugler.
    2. Drej hjernen, så skærelinjen vender opad. For at afsløre den laterale ventrikel skal du forsigtigt trække cortex væk fra thalamus.
    3. Træk hippocampus tilbage til den midtsagittale skærelinje. Den laterale ventrikel er nu synlig med CP liggende i bunden af ventriklen. Åbn om nødvendigt ventriklen lidt ved at trække bindevævet op med skarpe tang. På denne måde bliver CP mere synlig og lettere at nå.
    4. Brug små skarpe tang til forsigtigt at rive CP ud af ventrikelvæggen.
      BEMÆRK: Det er vigtigt kun at røre ved og tage CP ud i dette trin for ikke at forurene prøven med det omgivende væv. Åbning af ventriklerne som beskrevet i trin 2.3.4 vil lette trin 2.3.5. Vær forsigtig i dette trin for at bevare strukturen i CP så meget som muligt. Det er nemmest at begynde at trække CP i rostral til kaudal retning.

3. Morfologisk analyse af CP-væv ved hjælp af scanningelektronmikroskopi (SEM)

FORSIGTIG: Giftige opløsninger anvendes i følgende behandlingstrin. Det anbefales at udføre prøveforberedelsen i en stinkhætte.

  1. Udfør prøveforberedelse til SEM som beskrevet nedenfor.
    1. Den friske isolerede CP overføres til frisklavet fikseringsopløsning indeholdende 2% paraformaldehyd og 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M Na-cacodylatbuffer (pH 7,4). Der inkuberes natten over ved 4 °C.
      BEMÆRK: Da CP-vævet er meget skrøbeligt og tyndt, skal vævet lægges i små prøvekurve (se materialetabel) for at overføre det mellem buffere. På denne måde bevares vævets struktur bedre. Et cacodylatbaseret fikseringsmiddel anvendes over et PBS-baseret, da den stærke cacodylatbuffer kan modvirke glutaraldehyds lave pH i EM-fikseringsmidlet.
    2. Prøven vaskes 3x i 5 minutter hver med 3-5 ml 0,1 M Na-cacodylatbuffer (pH 7,4).
    3. Prøverne efterfikseres i 3-5 ml 2% osmiumtetroxid i 0,1 M Na-cacodylatbuffer i 30 min. Vask prøverne 3x i 5 min hver med 3-5 ml ultrarent vand.
    4. Dehydrer prøverne i en række iskolde opløsninger med stigende EtOH-koncentrationer (50%, 70%, 85%, 100%) i 15 minutter pr. EtOH-opløsning. Brug en kritisk punkttørrer til at spidstørre prøven korrekt.
      BEMÆRK Skift fra væske- til gasfase påvirker overfladespændingen og forårsager skade på overfladestrukturen. Det kritiske punkttørringstrin muliggør bevarelse af overfladestrukturen.
    5. Placer prøven forsigtigt på en prøveholder, der er forsynet med et carbon-klistermærke (se materialetabellen).
    6. Coat prøverne med et tyndt lag (2-5 nm) platin. For at gøre dette skal du montere en platinkilde i et vakuumsystem mellem to elektriske terminaler med høj strøm og opvarme platin til dens fordampningstemperatur. En fin strøm af platin deponeres på prøven.
      BEMÆRK: En mere detaljeret protokol for dette trin findes i reference30. Udover platin kan guld eller guld/palladium også bruges.
  2. Visualiser CP-prøverne med SEM (se materialetabel). Visualiseringsproceduren for CP-væv via SEM svarer til den for andre typer væv og afhænger af den anvendte software og instrumenter. En trin for trin SEM-protokol med en ledsagende video er tilgængelig i reference31 eller reference30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den beskrevne protokol letter effektiv isolering af CP fra musehjernens laterale (figur 2A-C) og fjerde (figur 2D-F) ventrikler. Efter isolering af hele hjernen bruges tang til sagittalt hemisect hjernen og identificere CP'erne, der flyder i laterale ventrikler. CP fra fjerde ventrikel kan isoleres fra den cerebellære side af hjernen. Perfusion med bromphenolblåt kan bruges til at visualisere CP (figur 2A, D); Når bromphenolblåt imidlertid ikke er tilladt i de videre forarbejdningstrin, kan der udføres perfusion med PBS/heparin (figur 2C,F) eller ingen perfusion (figur 2B,E). Efter isolering af CP ud af hjernens ventrikler kan der udføres et helt repertoire af analyser på vævet. Disse omfatter genekspressionsprofilering (RT-qPCR)28, celletypeprofilering (flowcytometri32, enkeltcelle-RNA-sekventering26,27) og påvisning af cytokiner og kemokiner 28via enzymbundet immunosorbentassay (ELISA), immunoblot, eller multiplex immunoassays. Desuden kan den mikrodissekerede CP placeres i kultur for at gøre CP-eksplantater for yderligere at belyse funktionen og for eksempel studere dets sekretom som reaktion på en specifik stimulus23,28,29. I dette manuskript beskriver vi, hvordan man udfører scanningelektronmikroskopi (SEM) for morfologisk at analysere overfladen af choroid plexus epitelceller (CPE). Figur 3 viser oversigtsbilleder af CP isoleret fra fjerde ventrikel (figur 3A) og CP isoleret fra lateral ventrikel (figur 3B), opnået via SEM. Disse billeder viser tydeligt den typiske C-formede form af lateral CP og toarmstrukturen af den fjerde ventrikel CP. 

Figure 3
Figur 3: Oversigt scanning elektronmikroskopi (SEM) billeder af det dissekerede choroid plexus (CP) væv. (A,B) Repræsentativt SEM-billede af CP isoleret ud af (A) fjerde og (B) laterale ventrikler i musehjernen. Skalabjælke = 100 μm. Indstillinger: elektronhøjspænding (EHT) = 5,00 kV; arbejdsafstand (WD) = 4,8 mm Klik her for at se en større version af denne figur.

Ved at zoome ind på CPE-cellerne kan andre celler på den apikale side af CPE-cellerne detekteres (figur 4A). Cellen fanget i billedet er muligvis en epiplexuscelle, en makrofaglignende celle, der ligger på den apikale overflade af CP. Det er imidlertid ikke muligt at identificere denne celles specifikke karakter via SEM. Ud over SEM-billeddannelse er det muligt at udføre to-fotonbilleddannelse af choroid plexusepitel i levende eksplanter, som vist af Shipley et al.29. Mens SEM letter visualiseringen af overfladestrukturer i CP, kan to-fotonbilleddannelse muliggøre visualisering af en bred vifte af celler og cellulære processer, så længe de kan overvåges fluorescerende. Dette omfatter visualisering af vaskulære og immunceller samt sekretoriske hændelser i CP-eksplant29.

En højere SEM-forstørrelse afslørede vesikellignende strukturer på den apikale side af CPE-celler (figur 4B) såvel som mikrovilli (figur 4C). Disse mikrovilli stikker ud i cerebrospinalvæsken (CSF) og øger CPE-celleoverfladearealet mellem cellerne og CSF. Disse resultater viser, at de morfologiske ændringer af CPE-cellerne under sygdomstilstande kan undersøges ved hjælp af SEM.

Figure 4
Figur 4: Detaljerede scanningelektronmikroskopi (SEM) billeder af choroid plexus (CP) væv. (A) En celle på den apikale side af choroid plexus epitel (CPE) celler. Skalabjælke = 2 μm. (B) Vesikellignende strukturer på den apikale side af CPE-celler. Skalabjælke = 10 μm. (C) Visualisering af en CPE-celleoverflade med dens mikrovilli. Skalabjælke = 1 μm. Indstillinger: elektronhøjspænding (EHT) = 5,00 kV; arbejdsafstand (WD) = 4,9 mm; 3.000x forstørrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskrives en metode til at isolere choroid plexus (CP) ud af den laterale ventrikel og den fjerde ventrikel i en musehjerne. Hele denne monteringsmetode for CP letter yderligere analyse ved hjælp af et repertoire af teknikker for at få et komplet overblik over CP-morfologien, cellulær sammensætning, transkriptom, proteom og sekretom. Sådanne analyser er afgørende for at få en bedre forståelse af denne bemærkelsesværdige struktur, der stikker ud fra hjernens ventrikler. Denne viden er af enorm forskningsinteresse, da det bliver mere og mere klart, at CP spiller en afgørende rolle i sundhed og sygdom 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18.

Kritiske trin, ændringer og fejlfinding af metoden
Det er yderst vigtigt at kontrollere musens fodrefleks for at sikre, at terminalbedøvelsen udføres godt. Udover etiske grunde sikrer dette også, at musen bevares på det rigtige sted, mens den eksperimentelle procedure udføres. Målet er at bedøve dyret, så det ikke oplever smerte under proceduren, mens hjertet slår på perfusionstidspunktet. Hvis yderligere behandling af vævet kræver fjernelse af blod, kan transkardieperfusion udføres. Saltvand indeholdende heparin bruges her for at undgå blodkoagulation. EDTA kan også bruges til dette formål, men hvis det er nødvendigt at bevare cellelevedygtigheden, er heparin et bedre valg end EDTA. Perfusion bør startes straks, når hjertet holder op med at slå på grund af overdreven anæstesi. En perfusionspumpe foretrækkes frem for manuel administration af væsken, da dette muliggør væsketilførsel med en præcist programmeret hastighed og sikrer, at forskydningskræfterne forårsaget af perfusionen ikke er for stærke. Overdreven forskydningskræfter vil kompromittere levedygtigheden og strukturen af celler inden for CP.

Det kræver et trænet øje at kunne se CP flyde i musens hjerneventrikler. Af denne grund er det yderst vigtigt at øve meget. Det anbefales at starte træningen på mus, der er perfunderet med bromphenolblåt, da dette vil plette CP'en i blåt og gøre det lettere at skelne det lille CP-væv fra resten af hjernen (figur 2A, D). I senere forsøg kan CP isoleres fra en ikke-perfuseret mus. Dette er sværere sammenlignet med CP-isolering fra en bromphenolblåperfunderet mus, men CP-vævet kan stadig identificeres ud fra dets stærkt vaskulariserede natur (figur 2B, E). Først efter omfattende træning er det muligt at isolere CP-vævet ud af hjernens ventrikler fra en ikke-perfuseret mus uden forurening med hjerneparenchyma (figur 2C, F).

CP er en meget skrøbelig og tynd struktur, hvilket indebærer, at dens isolering skal udføres med den nødvendige forsigtighed for at bevare levedygtigheden, funktionen og strukturen af celler i den. Således skal forskellige trin i den beskrevne protokol udføres med den nødvendige præcision og forsigtighed for at bevare hjernens integritet. For det første er det vigtigt at halshugge musen tæt på skuldrene. Hvis snittet er for højt, kan cerebellum blive beskadiget, hvilket komplicerer isoleringen af CP i fjerde ventrikel. Dernæst skal kraniet fjernes omhyggeligt for ikke at skade hjernen. Når hjernen er isoleret, er det afgørende at holde den kold for at forhindre hjernen i at blive grødet, da dette vil komplicere CP-isolation betydeligt. For at gøre det er det vigtigt at placere hjernen på en iskold petriskål og tilføje iskold PBS over hjernen. Et vist uddannelsesniveau er nødvendigt for at udføre den beskrevne isolationsteknik, da dette vil forkorte behandlingstiden mellem halshugningen af musen og den endelige isolering af CP. En kort isolationsproces vil forbedre levedygtigheden og strukturbevarelsen af det isolerede væv. Endelig skal de værktøjer, der anvendes til isolering, især tangen, være skarpe og spidse for at lette hurtig og effektiv isolering af CP ud af ventriklerne. Man skal dog passe på ikke at beskadige strukturens integritet under isolering.

For at bevare vævsintegriteten under prøvebehandling for SEM kan CP lægges i små prøvekurve ved overførsel mellem buffere, så berøring af selve vævet kan undgås. Desuden anbefales det at udføre kritisk punkttørring, når vævet flyttes ud af EtOH-opløsningerne. Dette sikrer bevarelsen af overfladestrukturen af CP, herunder mikrovilli. Overfladespænding, forårsaget af overgangen fra væske til gasfase, kan beskadige sådanne strukturer.

Begrænsninger af metoden
Som tidligere nævnt er CP en lille struktur, og afhængigt af downstream-analyserne (f.eks. flowcytometri) kan det være nødvendigt at samle CP fra forskellige mus. En væsentlig hindring i CP-isolering er identifikationen af strukturen, når den stadig flyder i ventriklen. Den stærkt vaskulariserede karakter af CP letter dens korrekte identifikation (efter en vis træning) inde i hjernens ventrikulære hulrum. Men hvis blodholdige komponenter skal fjernes til yderligere analyse, er transkardial perfusion afgørende. Afhængigt af nedstrømsanalysen kan perfusion med bromphenolblåt udføres, hvilket vil plette CP-blåt og derved lette isoleringen af vævet. Desværre er denne visualiseringsteknik ikke altid mulig (f.eks. Til immunhistokemisk farvning). I sådanne tilfælde skal CP isoleres blindt, hvilket kræver tilstrækkelig træning. At lege med mikroskopets lysdiffraktion kan hjælpe med at identificere CP, der flyder i ventriklerne. Derudover beskriver dette manuskript isoleringen af CP, der flyder i fjerde og laterale ventrikler, mens isolering af den tredje ventrikel CP ikke diskuteres.

Betydning i forhold til eksisterende metoder
I denne protokol dissekeres CP først ud af hjernens ventrikler, før yderligere analyse udføres. Hvis en farvningsprocedure anvendes som opfølgende udlæsning, er det også muligt at plette hjernesektioner, der indeholder CP. Merværdien af sidstnævnte teknik er, at orienteringen af CP-vævet i ventriklerne og hjernen stadig er synlig, hvilket ikke er tilfældet, hvis CP først mikrodissekeres ud af hjernens ventrikler. På den anden side giver farvning af en hjernesektion, der indeholder CP, kun information fra det specifikke afsnit, mens farvning af den isolerede CP kan hjælpe med at indsamle information om hele CP.

Fordelen ved den beskrevne teknik er, at den bevarer levedygtigheden, funktionen og strukturen af cellerne i CP. Desuden letter denne metode fuldstændig isolering af CP, der flyder i de fjerde og laterale hjerneventrikler hos voksne mus. Der er tidligere rapporteret metoder til isolering af CP (f.eks. fra rottehjerner24 og musehvalpehjerner25). Det er dog vigtigt at overveje, at isolationsteknikken kan variere fra art til art og mellem unge og voksne aldre.

Yderligere anvendelser af teknikken
Udover at bevare levedygtigheden, funktionen og strukturen af celler i CP, letter denne isolationsteknik anvendelsen af downstream-teknikker for at få en dybere forståelse af CP-funktionen. For eksempel kan flowcytometri eller enkeltcelle RNA-sekventering udføres for at kvantificere og fænotypisk analysere CP-celler og infiltrere celler under visse sygdomstilstande26,27. Derudover kan CP's molekylære sammensætning undersøges for at vurdere tilstedeværelsen af cytokiner og kemokiner via enzymbundet immunosorbentassay (ELISA), immunoblot, eller samtidige analyser af flere cytokiner ved hjælp af et såkaldt cytokinperlearray. Desuden kan transkriptom-, vaskulær-, immuncellehistologi og sekretomanalyser udføres på de mikrodissekerede CP-eksplanter29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af den belgiske fond for Alzheimerforskning (SAO; projektnummer: 20200032), Research Foundation Flanders (FWO Vlaanderen; projektnumre: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) og Baillet Latour Fund. Vi takker VIB BioImaging Core for træning, støtte og adgang til instrumentparken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26G x 1/2 needle Henke Sass Wolf 4710004512
Aluminium specimen mounts EM Sciences 75220
Cacodylate buffer EM Sciences 11652
Carbon steel surgial blades Swann-Morton 0210 size: 0.45 mm x 12 mm
Carbon adhesive tabs -12 mm EM Sciences 77825-12
Critical point dryer  Bal-Tec  CPD030
Crossbeam 540 Zeiss SEM system
Forceps Fine Science Tools GmbH  91197-00
Glutaraldehyde EM Sciences 16220
Heparin Sigma-Aldrich H-3125
Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel Metrohm Belgium N.V CPA-7800160
Osmium Tetroxide  EM Sciences 19170
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Phosphate buffered saline (PBS) Lonza BE17-516F
Platinum  Quorum  Q150T ES PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered
Sodium pentobarbital Kela NV 514
Specimen Basket Stainless Steel EM Sciences 70190-01
Stemi DV4 Stereo microscope Zeiss
Surgical scissors Fine Science Tools GmbH  91460-11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vandenbroucke, R. E. A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging. Annals of the American Thoracic Society. 13, Suppl 5 407-410 (2016).
  2. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31 (4), Springer-Verlag. 497-511 (2009).
  3. Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation. Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).
  4. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  5. De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins. FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
  6. Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).
  7. Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
  8. Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430 (2020).
  9. Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders. Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).
  10. Brkic, M., et al. Amyloid βoligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases. Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).
  11. Vandenbroucke, R. E., et al. Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases. Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).
  12. Marques, F., et al. The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus. BMC Neuroscience. 10, 135 (2009).
  13. Marques, F., et al. The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain. Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).
  14. Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
  15. Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans. Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).
  16. Lehtinen, M. K., et al. The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy. Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).
  17. Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer's disease: more than just a barrier. Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).
  18. Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders. Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).
  19. Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).
  20. Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 30 (1), 17-26 (2012).
  21. Marques, F., et al. Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation. Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).
  22. Thouvenot, E., et al. The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells. Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).
  23. Vandendriessche, C., et al. Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143 (2021).
  24. Bowyer, J. F., et al. A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain. Journal of Visualized Experiments. (69), e4285 (2012).
  25. Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52991 (2015).
  26. Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
  27. Carloni, S., et al. Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation. Science. 374 (6566), 439-448 (2021).
  28. Van Hoecke, L., et al. Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type. C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482 (2021).
  29. Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
  30. Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (150), e59480 (2019).
  31. JoVE. Scanning Electron Microscopy (SEM). JoVE Science Education Database. , https://www.jove.com/v/5656/scanning-electron-microscopy-sem (2022).
  32. Pauwels, M., et al. Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics). Biomaterials. 290, 121830 (2022).

Tags

Neurovidenskab udgave 190 choroid plexus neurodegenerative sygdomme scanningelektronmikroskopi (SEM) centralnervesystemet hjernen
Mikrodissektion og helmonteret scanningelektronmikroskopi visualisering af musechoroid plexus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Van Wonterghem, E., Van Hoecke, L.,… More

Van Wonterghem, E., Van Hoecke, L., Van Imschoot, G., Verhaege, D., Burgelman, M., Vandenbroucke, R. E. Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus. J. Vis. Exp. (190), e64733, doi:10.3791/64733 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter