Desarrollo rápido de circuitos de identificación del estado celular con politransfección

Summary

Los circuitos genéticos complejos requieren mucho tiempo para diseñar, probar y optimizar. Para facilitar este proceso, las células de mamíferos se transfectan de una manera que permite la prueba de múltiples estequiometrías de los componentes del circuito en un solo pozo. Este protocolo describe los pasos para la planificación experimental, la transfección y el análisis de datos.

Abstract

Los circuitos genéticos de mamíferos han demostrado el potencial para detectar y tratar una amplia gama de estados de enfermedad, pero la optimización de los niveles de los componentes del circuito sigue siendo un desafío y requiere mucha mano de obra. Para acelerar este proceso, nuestro laboratorio desarrolló la politransfección, una extensión de alto rendimiento de la transfección tradicional de mamíferos. En la politransfección, cada célula de la población transfectada esencialmente realiza un experimento diferente, probando el comportamiento del circuito en diferentes números de copias de ADN y permitiendo a los usuarios analizar un gran número de estequiometrías en una reacción de un solo recipiente. Hasta ahora, se han demostrado politransfecciones que optimizan las proporciones de circuitos de tres componentes en un solo pocillo de células; En principio, el mismo método se puede utilizar para el desarrollo de circuitos aún más grandes. Los resultados de la politransfección se pueden aplicar fácilmente para encontrar proporciones óptimas de ADN a cotransfecto para circuitos transitorios o para elegir niveles de expresión para componentes de circuitos para la generación de líneas celulares estables.

Aquí, demostramos el uso de la politransfección para optimizar un circuito de tres componentes. El protocolo comienza con los principios de diseño experimental y explica cómo la politransfección se basa en los métodos tradicionales de cotransfección. A continuación, se lleva a cabo la politransfección de células y seguida de citometría de flujo unos días después. Finalmente, los datos se analizan examinando cortes de los datos de citometría de flujo de una sola célula que corresponden a subconjuntos de células con ciertas proporciones de componentes. En el laboratorio, la politransfección se ha utilizado para optimizar clasificadores celulares, controladores de retroalimentación y feedforward, motivos biestables y muchos más. Este método simple pero poderoso acelera los ciclos de diseño para circuitos genéticos complejos en células de mamíferos.

Introduction

El campo de la biología sintética de mamíferos ha progresado rápidamente, desde el desarrollo de partes simples de detección y respuesta en líneas celulares cultivadas hasta la optimización de redes complejas de genes para abordar los desafíos del mundo real en diagnóstico y terapéutica¹. Estos sofisticados circuitos son capaces de detectar entradas biológicas desde perfiles de microARN hasta citoquinas y fármacos de moléculas pequeñas, e implementar circuitos de procesamiento lógico que incluyen transistores, filtros de paso de banda, interruptores de palanca y osciladores. También han mostrado resultados prometedores en modelos animales de enfermedades como el cáncer, la artritis, la diabetes y muchos más 1,2,3,4,5. Sin embargo, a medida que crece la complejidad de un circuito, optimizar los niveles de cada uno de sus componentes se vuelve cada vez más desafiante.

Un tipo particularmente útil de circuito genético es un clasificador celular, que puede programarse para detectar y responder a los estados celulares. La producción selectiva de proteínas o salidas de ARN en estados celulares específicos es una herramienta poderosa para guiar y programar la diferenciación de células y organoides, identificar y destruir células enfermas y/o tipos de células indeseables, y regular la función de las células terapéuticas 1,2,3,4,5 . Sin embargo, la creación de circuitos en células de mamíferos que puedan clasificar con precisión los estados celulares de múltiples especies celulares de ARN y / o proteínas ha sido muy desafiante.

Uno de los pasos más lentos del desarrollo de un circuito de clasificación celular es optimizar los niveles de expresión relativos de los genes componentes individuales, como sensores y factores de procesamiento, dentro del circuito. Para acelerar la optimización de circuitos y permitir la construcción de circuitos más sofisticados, trabajos recientes han utilizado modelos matemáticos de circuitos clasificadores celulares y sus componentes para predecir composiciones y topologías óptimas ^6,7. Si bien esto ha mostrado resultados poderosos hasta ahora, el análisis matemático está limitado por la necesidad de caracterizar sistemáticamente el comportamiento de entrada-salida de los genes componentes en el circuito, lo que lleva mucho tiempo. Además, una miríada de problemas dependientes del contexto pueden surgir en circuitos genéticos complejos, haciendo que el comportamiento de un circuito completo desafíe las predicciones basadas en caracterizaciones de partes individuales ^8,9.

Para desarrollar y probar más rápidamente circuitos complejos de mamíferos, como los clasificadores de estado celular, nuestro laboratorio desarrolló una técnica llamada politransfección¹⁰, una evolución de los protocolos de cotransfección de plásmidos. En la cotransfección, múltiples especies de ADN plásmido se complejan junto con un reactivo lipídico o polimérico cargado positivamente, y luego se entregan a las células de manera correlacionada (Figura 1A). En la politransfección, los plásmidos se complejan por separado con el reactivo, de modo que el ADN de cada complejo de transfección se entrega a las células de manera descorrelacionada (Figura 1B). Usando este método, las células dentro de la población transfectada están expuestas a numerosas combinaciones de proporciones de dos o más cargas útiles de ADN que transportan diferentes componentes del circuito.

Para medir las proporciones de los componentes del circuito entregados a cada célula, cada complejo de transfección dentro de una politransfección contiene un reportero fluorescente expresado constitutivamente que sirve como un proxy para la absorción celular del complejo. El ADN de relleno que no contiene ningún elemento activo dentro de una célula de mamífero se utiliza para ajustar la cantidad relativa del reportero fluorescente y los componentes del circuito entregados a una célula en un solo complejo de transfección y se discute con más detalle en la discusión. Un ejemplo de ADN de relleno utilizado en el laboratorio de Weiss es un plásmido que contiene una secuencia terminadora, pero no promotor, secuencia codificante, etc. Las células con diferentes proporciones de componentes del circuito se pueden comparar para encontrar proporciones óptimas para la función del circuito génico. Esto a su vez produce predicciones útiles para elegir promotores y otros elementos del circuito para lograr niveles óptimos de expresión génica cuando se combinan componentes del circuito en un solo vector para la integración genética (por ejemplo, un lentivirus, transposón o plataforma de aterrizaje). Por lo tanto, en lugar de elegir relaciones entre los componentes del circuito basadas en la intuición o mediante un proceso de prueba y error que consume mucho tiempo, la politransfección evalúa una amplia gama de estequiometrías entre partes genéticas en una reacción de un solo bote.

En nuestro laboratorio, la politransfección ha permitido la optimización de muchos circuitos genéticos, incluidos clasificadores celulares, controladores de retroalimentación y feedforward, y motivos biestables. Este método simple pero poderoso acelera significativamente los ciclos de diseño para circuitos genéticos complejos en células de mamíferos. Desde entonces, la politransfección se ha utilizado para caracterizar varios circuitos genéticos para revelar sus funciones multidimensionales de transferencia de entrada-salida a alta resolución 10, optimizar una topología de circuito alternativo para la clasificación del estado celular¹¹ y acelerar varios proyectos publicados ^12,13 y en curso.

Aquí describimos y describimos el flujo de trabajo para usar la politransfección para optimizar rápidamente un circuito genético (Figura 2). El protocolo muestra cómo generar datos de politransfección de alta calidad y evitar varios errores comunes en el protocolo de politransfección y el análisis de datos (Figura 3). Luego demuestra cómo usar la politransfección para caracterizar componentes de circuitos simples y, en el proceso, comparar los resultados de la politransfección con la cotransfección (Figura 4). Finalmente, los resultados de la politransfección muestran una optimización del circuito clasificador de cáncer (Figura 5).

Protocol

NOTA: La Tabla 1 y la Tabla 2 sirven como referencias significativas para este protocolo. La Tabla 1 muestra la escala de reactivos para las reacciones, y la Tabla 2 muestra la aritmética de la relación de ADN para un ejemplo de politransfección descrita en el protocolo (mitad superior) y para un posible experimento de seguimiento (mitad inferior). 1. Preparación de células para la transfección <li…

Representative Results

En la Figura 1, comparamos la co-transfección con la poli-transfección. En una co-transfección, todos los plásmidos se entregan en la misma mezcla de transfección, lo que resulta en una alta correlación entre la cantidad de cada plásmido que recibe cualquier célula individual (Figura 1A). Si bien el número total de plásmidos entregados a cada célula varía significativamente, la fluorescencia de las dos proteínas reporteras en las células individual…

Discussion

Los métodos de creación rápida de prototipos, como el diseño asistido por computadora (CAD), el breadboard y la impresión 3D, han revolucionado las disciplinas mecánicas, eléctricas y de ingeniería civil. La capacidad de buscar rápidamente a través de muchas soluciones posibles a un desafío dado acelera enormemente el progreso en un campo. Creemos que la politransfección es una tecnología análoga para la ingeniería biológica, que permite la creación rápida de prototipos de circuitos genéticos. Además,…

Materials

15mL Corning Falcon conical tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24-well petri dish	Any company of choice		(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin	NEB	B9000S
Centrifuge	Any company of choice		Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Non-commercial software package		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Use the correct media for your cell type
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F4135
HEK cells	ATCC	CRL-1573	Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells	ATCC	CRL-12401	Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer	ThermoFisher Scientific	L3000001	Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences	N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Any company of choice
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	reduced serum medium
Phosphate buffered saline	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow calibration beads	Spherotech	URCP-100-2H
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Trypsin	VWR	25-053-CI