Poli-Transfeksiyonlu Hücre Durumu Tanımlama Devrelerinin Hızlı Gelişimi
Summary
Karmaşık genetik devrelerin tasarlanması, test edilmesi ve optimize edilmesi zaman alıcıdır. Bu işlemi kolaylaştırmak için, memeli hücreleri, devre bileşenlerinin çoklu stokiyometrilerinin tek bir kuyuda test edilmesine izin verecek şekilde transfekte edilir. Bu protokol, deneysel planlama, transfeksiyon ve veri analizi adımlarını özetlemektedir.
Abstract
Memeli genetik devreleri, çok çeşitli hastalık durumlarını algılama ve tedavi etme potansiyelini göstermiştir, ancak devre bileşenlerinin seviyelerinin optimizasyonu zorlu ve emek yoğun olmaya devam etmektedir. Bu süreci hızlandırmak için laboratuvarımız, geleneksel memeli transfeksiyonunun yüksek verimli bir uzantısı olan poli-transfeksiyonu geliştirdi. Poli-transfeksiyonda, transfekte popülasyondaki her hücre esasen farklı bir deney yapar, devrenin davranışını farklı DNA kopya numaralarında test eder ve kullanıcıların tek bir pot reaksiyonunda çok sayıda stokiyometriyi analiz etmelerine izin verir. Şimdiye kadar, tek bir hücre kuyucuğundaki üç bileşenli devrelerin oranlarını optimize eden poli-transfeksiyonlar gösterilmiştir; Prensip olarak, aynı yöntem daha büyük devrelerin geliştirilmesi için de kullanılabilir. Poli-transfeksiyon sonuçları, geçici devreler için DNA’nın ko-transfekt’e optimal oranlarını bulmak veya kararlı hücre hatlarının oluşturulması için devre bileşenleri için ekspresyon seviyelerini seçmek için kolayca uygulanabilir.
Burada, üç bileşenli bir devreyi optimize etmek için poli-transfeksiyonun kullanımını gösteriyoruz. Protokol, deneysel tasarım ilkeleriyle başlar ve poli-transfeksiyonun geleneksel ko-transfeksiyon yöntemlerine nasıl dayandığını açıklar. Daha sonra, hücrelerin poli-transfeksiyonu gerçekleştirilir ve birkaç gün sonra akış sitometrisi ile takip edilir. Son olarak, veriler, belirli bileşen oranlarına sahip hücrelerin alt kümelerine karşılık gelen tek hücreli akış sitometri verilerinin dilimleri incelenerek analiz edilir. Laboratuvarda, hücre sınıflandırıcılarını, geri besleme ve besleme denetleyicilerini, iki kararlı motifleri ve daha fazlasını optimize etmek için poli-transfeksiyon kullanılmıştır. Bu basit ama güçlü yöntem, memeli hücrelerindeki karmaşık genetik devreler için tasarım döngülerini hızlandırır.
Introduction
Memeli sentetik biyolojisi alanı, kültürlenmiş hücre hatlarında basit duyu ve tepki parçaları geliştirmekten, teşhis ve terapötiklerdeki gerçek dünyadaki zorlukları ele almak için karmaşık gen ağlarının optimizasyonuna kadar hızla ilerlemiştir1. Bu sofistike devreler, mikroRNA profillerinden sitokinlere ve küçük moleküllü ilaçlara kadar biyolojik girdileri algılayabilir ve transistörler, bant geçiş filtreleri, geçiş anahtarları ve osilatörler dahil olmak üzere mantık işleme devrelerini uygulayabilir. Ayrıca kanser, artrit, diyabetve daha birçok 1,2,3,4,5 gibi hastalıkların hayvan modellerinde umut verici sonuçlar göstermiştir. Bununla birlikte, bir devrenin karmaşıklığı arttıkça, bileşenlerinin her birinin seviyelerini optimize etmek giderek daha zor hale gelir.
Özellikle yararlı bir genetik devre türü, hücresel durumları algılamak ve bunlara yanıt vermek için programlanabilen bir hücre sınıflandırıcıdır. Belirli hücresel durumlarda protein veya RNA çıktılarının seçici üretimi, hücrelerin ve organoidlerin farklılaşmasını yönlendirmek ve programlamak, hastalıklı hücreleri ve / veya istenmeyen hücre tiplerini tanımlamak ve yok etmek ve terapötik hücrelerin işlevini düzenlemek için güçlü bir araçtır 1,2,3,4,5 . Bununla birlikte, memeli hücrelerinde, hücre durumlarını çoklu hücresel RNA ve / veya protein türlerinden doğru bir şekilde sınıflandırabilen devreler oluşturmak oldukça zor olmuştur.
Bir hücre sınıflandırma devresi geliştirmenin en çok zaman alan adımlarından biri, devre içindeki sensörler ve işleme faktörleri gibi bireysel bileşen genlerinin göreceli ekspresyon seviyelerini optimize etmektir. Devre optimizasyonunu hızlandırmak ve daha sofistike devrelerin inşasına izin vermek için, son çalışmalar optimal kompozisyonları ve topolojileri tahmin etmek için hücre sınıflandırıcı devrelerinin ve bileşenlerinin matematiksel modellemesini kullanmıştır 6,7. Bu şimdiye kadar güçlü sonuçlar göstermiş olsa da, matematiksel analiz, devredeki bileşen genlerinin giriş-çıkış davranışını sistematik olarak karakterize etme ihtiyacı ile sınırlıdır ve bu da zaman alıcıdır. Ayrıca, karmaşık genetik devrelerde bağlama bağlı sayısız problem ortaya çıkabilir ve bu da tam bir devrenin davranışının bireysel parça karakterizasyonlarına dayanan tahminlere meydan okumasına neden olabilir 8,9.
Hücre durumu sınıflandırıcıları gibi karmaşık memeli devrelerini daha hızlı geliştirmek ve test etmek için laboratuvarımız, plazmid ko-transfeksiyon protokollerinin bir evrimi olan poli-transfeksiyon10 adı verilen bir teknik geliştirdi. Ko-transfeksiyonda, çoklu plazmid DNA türleri, pozitif yüklü bir lipit veya polimer reaktifi ile birlikte kompleksleştirilir, daha sonra hücrelere korelasyonlu bir şekilde verilir (Şekil 1A). Poli-transfeksiyonda, plazmidler reaktif ile ayrı ayrı komplekslenir, böylece her transfeksiyon kompleksinden gelen DNA, hücrelere ilişkisiz bir şekilde iletilir (Şekil 1B). Bu yöntemi kullanarak, transfekte popülasyondaki hücreler, farklı devre bileşenleri taşıyan iki veya daha fazla DNA yükünün oranlarının sayısız kombinasyonuna maruz kalır.
Her hücreye verilen devre bileşenlerinin oranlarını ölçmek için, bir poli-transfeksiyon içindeki her transfeksiyon kompleksi, kompleksin hücresel alımı için bir vekil görevi gören yapısal olarak ifade edilen bir floresan muhabiri içerir. Bir memeli hücresi içinde aktif olan herhangi bir element içermeyen dolgu DNA’sı, tek bir transfeksiyon kompleksinde bir hücreye verilen floresan muhabirin ve devre bileşenlerinin nispi miktarını ayarlamak için kullanılır ve tartışmada daha ayrıntılı olarak tartışılır. Weiss laboratuvarında kullanılan dolgu DNA’sının bir örneği, bir sonlandırıcı dizisi içeren, ancak promotor, kodlama dizisi vb. İçermeyen bir plazmiddir. Farklı devre bileşenleri oranlarına sahip hücreler daha sonra gen devresi fonksiyonu için en uygun oranları bulmak için karşılaştırılabilir. Bu da, devre bileşenlerini genetik entegrasyon için tek bir vektörde (örneğin, bir lentivirüs, transpozon veya iniş pedi) birleştirirken optimum gen ekspresyon seviyelerine ulaşmak için promotörleri ve diğer devre elemanlarını seçmek için yararlı tahminler verir. Bu nedenle, sezgiye dayalı olarak veya zaman alıcı bir deneme yanılma süreci yoluyla devre bileşenleri arasındaki oranları seçmek yerine, poli-transfeksiyon, tek hazneli bir reaksiyonda genetik parçalar arasındaki çok çeşitli stokiyometrileri değerlendirir.
Laboratuvarımızda çoklu transfeksiyon, hücre sınıflandırıcıları, geri besleme ve besleme kontrolörleri ve iki kararlı motifler dahil olmak üzere birçok genetik devrenin optimizasyonunu sağlamıştır. Bu basit ama güçlü yöntem, memeli hücrelerindeki karmaşık genetik devreler için tasarım döngülerini önemli ölçüde hızlandırır. Poli-transfeksiyon o zamandan beri çok boyutlu giriş-çıkış transfer fonksiyonlarını yüksek çözünürlükte10’da ortaya çıkarmak, hücre durumu sınıflandırması 11 için alternatif bir devre topolojisini optimize etmek ve çeşitli yayınlanmış12,13 ve devam eden projeleri hızlandırmak için birkaç genetik devreyi karakterize etmek için kullanılmıştır.
Burada, bir genetik devreyi hızlı bir şekilde optimize etmek için çoklu transfeksiyon kullanma iş akışını açıklıyor ve tasvir ediyoruz (Şekil 2). Protokol, yüksek kaliteli poli-transfeksiyon verilerinin nasıl oluşturulacağını ve poli-transfeksiyon protokolünde ve veri analizinde birkaç yaygın hatadan nasıl kaçınılacağını göstermektedir (Şekil 3). Daha sonra, basit devre bileşenlerini karakterize etmek için poli-transfeksiyonun nasıl kullanılacağını gösterir ve bu süreçte, poli-transfeksiyon sonuçlarını ko-transfeksiyona karşı karşılaştırır (Şekil 4). Son olarak, poli-transfeksiyon sonuçları kanser sınıflandırıcı devresinin optimizasyonunu göstermektedir (Şekil 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Bilgisayar destekli tasarım (CAD), breadboard ve 3D baskı gibi hızlı prototipleme yöntemleri mekanik, elektrik ve inşaat mühendisliği disiplinlerinde devrim yarattı. Belirli bir zorluğa yönelik birçok olası çözümü hızlı bir şekilde arama yeteneği, bir alandaki ilerlemeyi büyük ölçüde hızlandırır. Poli-transfeksiyonun, genetik devrelerin hızlı prototiplenmesini sağlayan biyolojik mühendislik için benzer bir teknoloji olduğuna inanıyoruz. Ek olarak, diğer hızlı prototipleme teknolojil…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Poli-transfeksiyon yönteminin geliştirilmesine ve hücre sınıflandırıcılarına uygulanmasına öncülük eden veya katkıda bulunan eski Weiss Lab üyelerine teşekkür etmek isteriz: Jeremy Gam, Bre DiAndreth ve Jin Huh; Daha fazla yöntem geliştirme/optimizasyona katkıda bulunan diğer Weiss laboratuvar üyeleri: Wenlong Xu, Lei Wang ve Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard ve Patrick Donahue ve Hailey Edelstein da dahil olmak üzere grup üyeleri, çoklu transfeksiyonu test etmek ve geri bildirim sağlamak için; ve Prof. Nika Shakiba bu makaleyi davet ettiği ve geri bildirimde bulunduğu için. Ulusal Sağlık Enstitüleri’ne [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792] de teşekkür ederiz; Ulusal Bilim Vakfı [1745645]; Bu çalışmayı finanse etmek için NCI’den Kanser Merkezi Desteği (çekirdek) Hibe [P30CCA14051, kısmen] ve Ulusal Sağlık Enstitüleri [P50GM098792].
Materials
| 15mL Corning Falcon conical tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| 24-well petri dish | Any company of choice | (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free) | |
| Bovine serum albumin | NEB | B9000S | |
| Centrifuge | Any company of choice | Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| Cytoflow | Non-commercial software package | https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# | |
| DMEM | VWR | 10-013-CV | Use the correct media for your cell type |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
| HEK cells | ATCC | CRL-1573 | Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently. |
| HeLa cells | ATCC | CRL-12401 | Use the relevant cell type for your experiments. |
| Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer | ThermoFisher Scientific | L3000001 | Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent |
| LSRFortessa flow cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Any company of choice | ||
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985070 | reduced serum medium |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Rainbow calibration beads | Spherotech | URCP-100-2H | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Trypsin | VWR | 25-053-CI |
Referências
- Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells. Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).
- Sayeg, M. K., et al. Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).
- Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
- Nissim, L., et al. Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy. Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).
- Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells. Molecular Systems Biology. 6, 444 (2010).
- Mohammadi, P., Castel, S. E., Brown, A. A., Lappalainen, T. Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change. Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).
- Prochazka, L., et al. Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human. BioRxiv. , (2021).
- Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).
- Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
- Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. A ‘poly-transfection’ method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems. Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).
- Jones, R. D., et al. Robust and tunable signal processing in mammalian cells via engineered covalent modification cycles. Nature Communications. 13 (1), 1720 (2022).
- Jones, R. D., et al. An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 5690 (2020).
- DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases. Nature Communications. 13 (1), 2582 (2022).
- Frei, T., et al. Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 4641 (2020).
- Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report. Massachusetts institute of technology. , (2012).
- Beal, J., et al. Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks. ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).
- Teague, B. Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry. bioRxiv. , (2022).
- Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames). Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).
- Michaels, Y. S., et al. Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells. Nature Communications. 10 (1), 818 (2019).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Wroblewska, L., et al. Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery. Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).
- Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. miR-21 as a key regulator of oncogenic processes. Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).
- Stanton, B. C., et al. Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates. Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).
- Stanton, B. C., et al. Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells. ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).
