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Biology

凍結保存された上皮陰窩からの子豚腸3Dオルガノイドの培養と細胞単分子膜の樹立

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64917
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 2, 4, 1, 1
1GenPhySE, Université de Toulouse, INRAE, ENVT, 2Lallemand Animal Nutrition, 3Institut NuMeCan, INRAE, INSERM, Université de Rennes, 4FG 16: Mycotic and Parasitic Agents and Mycobacteria, Robert Koch-Institute

Summary

ここでは、凍結保存された上皮陰窩からブタ腸管3Dオルガノイドを培養するためのプロトコルを記載する。また、3Dオルガノイド由来の細胞単分子膜を確立し、上皮細胞の頂端側へのアクセスを可能にする方法についても説明します。

Abstract

腸内オルガノイドは、消化器疾患モデリングのための腸上皮の研究、または薬物、栄養素、代謝産物、病原体、および微生物叢との相互作用の調査にますます使用されています。腸管オルガノイドの培養方法は、家畜としても、人獣共通感染症の研究など、ヒトのトランスレーショナルモデルとしても大きな関心を集めているブタを含む複数の種で利用可能になりました。ここでは、凍結上皮陰窩からブタ腸3Dオルガノイドを培養するために使用される手順の詳細な説明を与える。このプロトコルでは、ブタの腸から上皮陰窩を凍結保存する方法と、その後の3D腸管オルガノイドを培養する手順について説明しています。この方法の主な利点は、(i)3Dオルガノイドの培養物からの陰窩の単離の時間的解離、(ii)複数の腸セグメントおよび複数の動物に由来する凍結保存された陰窩の大量ストックの調製、したがって(iii)生きている動物から新鮮な組織をサンプリングする必要性の減少である。また、栄養素、微生物、または薬物との相互作用の部位である上皮細胞の頂端側へのアクセスを可能にするために、3Dオルガノイドに由来する細胞単層を確立するためのプロトコルについても詳しく説明します。全体として、ここで説明するプロトコルは、獣医学および生物医学研究においてブタ腸上皮を研究するための有用なリソースです。

Introduction

腸上皮は、管腔環境との界面で消化粘膜を覆う細胞の単層によって形成される。この位置は、幹細胞や複数の分化した上皮細胞タイプ(吸収細胞、腸内分泌細胞、パネス細胞、杯細胞)の存在によって支えられている栄養素吸収やバリア機能などの多様な機能に関連しています1。上皮細胞の研究に伝統的に使用されている不死化細胞株は、腸上皮の細胞の複雑さを反映しておらず、ゲノム異常が存在するため、大きな制限があります2。佐藤らによる 3次元(3D)オルガノイドの開発3は、生理学的関連性が改善された腸上皮を研究するための新しいモデルを提供しました。実際、腸管オルガノイドは非形質転換幹細胞に由来し、複数の細胞型で構成され、腸上皮の機能を要約しています。腸管オルガノイドは、腸上皮の発生と機能、および病原体、栄養素、毒素、薬物、微生物叢、およびその代謝物との相互作用を理解するためにますます使用されています2。

当初はヒトとマウス用に開発されましたが、腸管オルガノイドの培養に使用される方法は、最近、ブタ4を含む他の種に適応しています。Gonzalesら5は、空腸からブタオルガノイドを培養した最初の人でした。それ以来、ブタオルガノイドは他の腸セグメント(十二指腸、回腸、結腸)6,7,8について記載されており、位置特異的な表現型を保持していることが示されています9,10,11。ブタ腸3Dオルガノイドは現在、栄養素12、13または腸内感染症6、8、14の影響を研究するために一般的に使用されている。

ほとんどの研究は、新たに単離された上皮陰窩から始まる腸オルガノイドの培養について説明しています。ただし、これは、特に豚などの大型動物を扱う場合、ロジスティック上の理由から常に実行可能であるとは限りません。実際、豚用の動物施設は、オルガノイドが培養されている実験室から遠く離れた場所にある可能性があるため、作業組織を複雑にします。さらに、オルガノイド培養には時間がかかります。したがって、例えば、異なる腸セグメントまたは複数の動物から、複数のオルガノイド株を同時に成長させることは実用的ではありません。これらの問題を回避するために、ヒト、ウマ、およびブタにおけるいくつかの研究では、凍結腸組織(または生検)または単離された上皮陰窩からオルガノイドを培養する方法が記載されている4,15,16,17。これらの方法により、単一の動物の複数の腸セグメントからの腸上皮幹細胞の凍結保存が可能になり、必要に応じてオルガノイドを増殖させるために使用できます。さらに、これにより、凍結保存された陰窩を大量に作成できるため、幹細胞のドナーとして使用される生きた動物の数を大幅に減らすことができます(3Rの原則)。この方法の他の利点は、表現型または遺伝子型の結果が得られた後に関心のある動物からのみ腸オルガノイドを増殖させることであり、これは非常に費用効果が高い。

生体内では、腸管上皮細胞は分極しており、頂端側は内腔に向けられています。in vitroでは、3Dオルガノイドでは、上皮細胞の頂端側も内腔(すなわち、オルガノイドの内側)に面しています4。この組織は、上皮細胞に対する管腔成分(例えば、栄養素、微生物、代謝物)の影響を研究する際に問題となる頂端側へのアクセスを妨げる。この欠点を回避するために、オルガノイド細胞を2D単層として培養する方法、マイクロインジェクション、極性反転(「頂端アウトオルガノイド」)など、いくつかの方法が開発されています18,19。オルガノイド細胞の単層の培養は、最も効率的で扱いやすいシステムとして浮上しています。原理は、3Dオルガノイドを単一細胞に解離し、細胞外マトリックス(ECM)20の薄層で予めコーティングした細胞培養容器に播種することです。これらの培養条件では、上皮細胞の頂端側が上向きであり、したがって実験的処置20にアクセス可能である。オルガノイド細胞単層の培養は、最近ブタの腸に適応した21,22;ブタ3Dオルガノイド由来の細胞単分子膜は、腸内感染症の研究6、23、24、25、栄養素の輸送9、消化器疾患モデリング26など、複数の用途に使用されています。

ここでは、この研究では、凍結保存された上皮陰窩に由来するブタ腸3Dオルガノイドの培養と維持のための詳細なプロトコルを最初に提示します(図1)。次に、ブタ腸3Dオルガノイドから細胞単層を確立するためのプロトコルが記載されている。ここで説明する方法は、栄養素輸送、バリア機能、および宿主と微生物の相互作用についてブタ腸上皮を研究するために使用できる実験ツールを提供します。

Protocol

この議定書は、科学的目的で使用される動物の保護に関する欧州指令(2010/63/EU)に従って、地元の倫理委員会(N°TOXCOM/0136/PP)によって承認されました。このプロトコルは、空腸について例として説明されていますが、小腸および大腸の各セグメント(十二指腸、空腸、回腸、結腸)に使用できます。

1.子豚の腸からの上皮陰窩の分離

注:10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン-ストレプトマイシン(P / S)を添加したDMEMを含む完全なダルベッコ改変イーグル培地(DMEMc)のストックを準備します。50 mLのアリコートを調製し、4°Cで1ヶ月間保存します。

  1. 溶液の準備(地下室隔離の日に行われる)
    1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、3 mMジチオスレイトール(DTT)、9 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、10 μM Y27632 ROCK阻害剤、および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(P / S)を含む解離溶液を調製し、氷上に保存します。
    2. DMEMc、10%FBS、10%ジメチルスルホキシド(DMSO)、および10 μM Y27632 ROCK阻害剤を含む凍結溶液を調製し、氷上に保存します(最終FBS濃度は18%)。
    3. 1%P/Sを添加したコールドPBSを含む輸送液を調製し、氷上に保管します。
  2. 上皮陰窩の単離
    1. 電気麻薬症とそれに続く放血によって子豚を屠殺する。
    2. 屠殺直後に、メスで子豚の腹部を開き、腸全体を取り除きます。
    3. 約2 cmの腸のセグメントを収集し、低温輸送液に保管します。陰窩分離まで(最大2時間)セグメントを氷上に保ちます。
    4. ティッシュをペトリ皿に入れます。腸のセグメントを縦方向に開き、1%P / Sを添加した冷たいPBSで組織を注意深く洗浄して、腸の内容物を取り除きます。
    5. 組織を、1%P / Sを添加した10 mLの冷たいPBSで満たされた新しいペトリ皿に移します。
    6. ピンセットで組織を保持し、顕微鏡スライドでこすることによって絨毛と残りの粘液を取り除きます。
      注:絨毛(舌状の構造)の除去は、上清の顕微鏡観察によって確認することができます。
    7. 組織を5 mLの氷冷解離溶液を含む15 mLのコニカルチューブに移し、回転シェーカー(15 rpm)で室温(RT)で30分間インキュベートします。
    8. 組織を新しいペトリ皿に移し、1%P / Sを添加した10mLの冷たいPBSを追加します。
    9. 顕微鏡スライドで粘膜をしっかりとこすることによって、陰窩を機械的に隔離します。
      注:顕微鏡下で、PBSに上皮陰窩が存在することを確認します(図2A)。
    10. 陰窩溶液を血清学的ピペットで吸引し、50 mLコニカルチューブ内の100 μmセルストレーナーを通してろ過します。
    11. 10μLの溶液をピペットし、顕微鏡下で陰窩の存在を確認します。300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
    12. 滅菌バイオセーフティキャビネットの下で、上清を廃棄し、10 μM Y27632 ROCK阻害剤を添加した10 mLのコールドDMEMcに陰窩のペレットを再懸濁します。
    13. 10 μLのクリプト溶液を48ウェルプレートにピペットします。顕微鏡下で10倍の倍率で陰窩の数を手動でカウントし、溶液1mLあたりの陰窩の濃度を計算します。
      注:単離された陰窩は、腸管オルガノイドの培養に直接使用できます。ただし、各子豚の地下室を大量に凍結保存し、後でオルガノイド培養に使用する方が便利なことがよくあります。
  3. 上皮陰窩の凍結
    1. 900個の陰窩に相当する容量を15 mLのコニカルチューブに移します。300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
    2. 上清を廃棄し、陰窩のペレットを1 mLの凍結溶液に再懸濁します。クライオチューブに移し、バイアルを細胞凍結容器に入れます。
    3. 細胞凍結容器を-80°Cで24時間保存した後、バイアルを液体窒素に移して長期保存します。

2. 凍結上皮陰窩からの子豚腸管3Dオルガノイドの樹立

注:子豚の腸3Dオルガノイドは、ヒトオルガノイドの増殖用に処方された市販の培養培地で培養され、1%P / Sおよび初代細胞用の抗菌剤100 μg/mLが補充され、4°Cで最大1週間保存されます。腫瘍由来の細胞外マトリックス(ECM)は、3Dオルガノイドの培養に使用されます。市販製品のすべての参照は、 材料表に記載されています。

  1. 材料の準備
    1. ピペットチップを-20°C(少なくとも一晩)に置きます。
    2. ECM(500 μL)の凍結アリコートを少なくとも1時間前に4°Cに置きます。
    3. 48ウェルプレートを37°C、5%CO2 インキュベーターで予熱します。
    4. 培養液をRTに置きます。
    5. 37°Cの水浴を予熱する。
    6. 無菌条件下でボンネットの下に小さな氷のバケツを置きます。
  2. 凍結上皮陰窩の融解
    1. 900個の凍結陰窩を含むバイアルを37°Cの水浴(5分未満)で素早く解凍します。
    2. クリプト溶液を15 mLコニカルチューブに移します。
    3. 300 x g でRTで5分間遠心分離し、上清を取り除きます
    4. 冷却されたチップで150 μLのECMを追加し、25 μLのECMあたり150の陰窩の最終濃度を得ます。ピペットを上下に10回使用して、ECM内の陰窩の均質な懸濁液を取得します。
      注意: 重合を避けるために、ECMは常に氷上に置いてください。ECMを操作するには、常に-20°Cで事前に冷却したピペットチップを使用してください。ECMで気泡が発生しないようにゆっくりとピペットします。このステップでは、小さな液滴が崩壊するのを防ぐために、希釈されていないECMが使用されます。
    5. 6つのウェルに、冷却したチップでウェルあたり25 μLのドロップを、事前に温めた48ウェルプレートに播種します。
      注意: 先端をウェルの中央に垂直に保ち、空気を導入せずにゆっくりとピペットでドームを作ります。ここでは、凍結した陰窩から始めるとオルガノイド数は通常低いため、48ウェルプレートが使用されます。
    6. ECMの重合のために37°C、5%CO2 インキュベーターで30分間インキュベートします。
    7. 培養液1ウェルあたり250 μLをRTで添加します。 37°C、5%CO2 インキュベーターでインキュベートし、2〜3日ごとに培地を交換します。
      注:陰窩は通常、解凍手順後には見えず、ほとんどの細胞はECMで解離します(図2B)。

3. 凍結陰窩由来の子豚腸3Dオルガノイドの通過

注:凍結した陰窩からオルガノイドを入手する時間は、通常、新鮮な陰窩から始めるときよりも長くなります。オルガノイドは通常、解凍後10日で分割する準備が整います(図2B)。

  1. 材料の準備
    1. ECM(500 μL)の凍結アリコートを4°Cで少なくとも1時間置きます。
    2. 24ウェルプレートを37°Cで予熱します。
    3. PBSと10 μM Y27632 ROCK阻害剤を添加した酵素解離試薬を37°Cの水浴中で予め温めます。
    4. 培養液をRTに置きます。
    5. 無菌条件下でボンネットの下に小さな氷のバケツを置きます。
  2. 凍結陰窩由来の3Dオルガノイドの通過
    1. 培養液を取り出し、37°Cで250 μLの予熱PBSで洗浄します。
    2. 10 μM Y27632 ROCK阻害剤を添加した250 μLの酵素解離試薬を各ウェルに37°Cで加えます。
      注:オルガノイドの数が少ないため、オルガノイドの解離は各ウェルで直接行われます。
    3. P1000ピペットで削ってECM内のオルガノイドを剥離し、5回ピペッティングして慎重にホモジナイズします。
    4. 37°C、5%CO2 インキュベーターで5分間インキュベートします。P1000ピペットを使用して上下に10回ピペッティングして細胞を解離します。
      注:目的は、単離された細胞またはスモールセルクラスター(<10セル)を取得することです。顕微鏡で解離を確認します。それでもオルガノイドの大きな断片が観察される場合は、手順3.2.4を繰り返します。
    5. 解離した細胞を含む各ウェルに500 μLのDMEMcを加え、3 mLのコールドDMEMcを含む15 mLのコニカルチューブに最大12個のウェルをプールします。
    6. 500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を廃棄し、ペレットを1 mLの冷DMEMcに再懸濁します。
    7. セルカウンターでトリパンブルーで1:2に希釈した細胞を数えます。
      注: 自動セル カウンターは、存在する場合、小さなクラスター内のセルをカウントできます。
    8. ドームあたり3,000個の生細胞(24ウェルプレートのウェルあたり1つのドーム)を持つために必要な量の細胞溶液を500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
    9. 氷上で生細胞3,000個あたり17 μLのコールドDMEMcで細胞を再懸濁します。必要なウェル数に容量を調整します。
    10. 3,000生細胞あたり冷却チップで33 μLのコールドECMをゆっくりと加え、気泡を作らずに氷上で均質化します。必要なウェル数に容量を調整します。
      注:細胞は、1/3 DMEMcおよび2/3 ECMを含む溶液に再懸濁されます。各ドームに対して、50μLのこの溶液が必要です。希釈ECMは安価でピペッティングが簡単です。
    11. ウェルあたり50 μLのECM細胞懸濁液を、冷却したチップでウェルに播種し、事前に温めた24ウェルプレートに入れます。
    12. ECMの重合のために37°C、5%CO2 インキュベーターで30分間インキュベートします。
    13. ウェルあたり500 μLの培養液を追加します。37°C、5%CO2 インキュベーターでインキュベートし、2〜3日ごとに培地を交換します。
      注:オルガノイドは、i)実験、ii)3Dオルガノイド培養の維持、iii)凍結、またはiv)オルガノイド細胞単層の播種に直接使用できます(図1)。オルガノイドの増殖を顕微鏡で毎日確認し、オルガノイドを分割する最適なタイミングを選択します。オルガノイドは、明確で空の内腔と明確に定義されたエッジを持っている必要があります。内腔に黒い破片がある成熟オルガノイドは、分割に使用しないでください(図3)。

4. 3Dオルガノイド培養の維持

注:継代の場合、オルガノイドは空のルーメンで透明に見えるはずです。黒い破片は、分裂後約5日で内腔に現れ、死んだ細胞の存在を示します。継代時の死細胞数を制限することは、培養物の最適な維持のために好ましい。したがって、スケジュールは、この成熟段階に達しないように調整する必要があります。

  1. 材料の準備
    1. ECM(500 μL)のアリコートを4°Cに置き、少なくとも1時間解凍します。
    2. 24ウェルプレートを37°Cで予熱します。
    3. 10 μM Y27632 ROCK阻害剤を添加した酵素解離試薬を37°Cの水浴中で予め温めます。
    4. 培養液をRTに置きます。
    5. 無菌条件下でボンネットの下に小さな氷のバケツを置きます。
  2. 腸管3Dオルガノイドの通過
    1. P1000ピペットでこすり、ECMでオルガノイドを剥離します。培養液中でピペッティングして注意深くホモジナイズし、氷上で5 mLのコールドDMEMcを含む15 mLのコニカルチューブに移します。
      注:24ウェルプレートの50 μLドームで培養された12ウェルのオルガノイドを含むプールには、15 mLコニカルチューブが1本必要です。
    2. 回収したオルガノイドを500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
      注:オルガノイドはチューブの底に白いペレットを形成します。遠心分離後もオルガノイドがECM内の懸濁液に残っている場合は、(ECM層に触れずに)上部上清を注意深く吸引し、P1000ピペットで10回ピペッティングしてホモジナイズし、遠心分離ステップを繰り返します。この手順の後、ECMレイヤーは表示されないはずです。
    3. 上清を注意深く吸引し、10 μM Y27632 ROCK阻害剤を添加した1 mLの予温酵素解離試薬に細胞ペレットを再懸濁します。ピペットを上下に10回動かしてオルガノイドの解離を開始します。
    4. 酵素消化のために37°Cの水浴中で5分間インキュベートします。
    5. P1000ピペットで10回ピペッティングすることにより、オルガノイドを機械的に破壊します。顕微鏡下で細胞懸濁液を確認します。
      注:目的は、単離された細胞またはスモールセルクラスターを取得することです。それでも大きなオルガノイド断片が観察される場合は、インキュベーション(ステップ4.2.4)と機械的破壊(ステップ4.2.5)を繰り返します。
    6. 4 mLの氷冷DMEMcを追加します。500 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離
    7. 上清を廃棄し、オルガノイド細胞ペレットを1 mLのDMEMcに再懸濁します。
    8. 上記のように進み(ステップ3.2.7から3.2.13)、細胞をカウントし、事前に温めた24ウェルプレートに3000個の生細胞を含む50 μLのECMドームにオルガノイド細胞を播種します。

5. 3Dオルガノイドの凍結

  1. 10%FBS、10%DMSO、および10 μM Y27632 ROCK阻害剤を添加したDMEMcを含む凍結溶液の必要量(2つのドームのプールに1 mL)を準備し、氷上に保存します(最終的なFBS濃度は18%)。
  2. 凍結するウェルから培地を取り出します。
  3. 凍結する最初のウェルに1 mLの凍結溶液を加え、こすってECMを剥離し、ピペットチップでホモジナイズします。
  4. オルガノイド懸濁液を凍結する第1のウェルから第2のウェルに移す。
  5. 2つのウェルのプールをクライオチューブに移し、バイアルを細胞凍結容器に入れます。
  6. 細胞凍結容器を-80°Cで24時間保管した後、バイアルを液体窒素に移して長期保存します。

6. 3Dオルガノイド由来の細胞単分子膜の培養

注:ブタオルガノイド細胞の単分子膜は、20%FBSを添加した3Dオルガノイドに使用される培養培地で構成される2D培地で培養されます。

  1. 材料の準備
    1. 2D メディアを準備し、RT のままにします。
    2. 10 μM Y27632 ROCK阻害剤を添加した酵素解離試薬を37°Cの水浴中で予め温めます。
  2. 培養インサートのコーティング
    1. ピンセットを滅菌し、バイオセーフティキャビネットに移します。
    2. 細胞培養インサート(0.33 cm2)をピンセット付きの24ウェルプレートに入れます。
    3. 冷PBSで50 μg/mLに希釈したコラーゲンIVを含むコーティング溶液を調製します。ピペットを上下に混ぜ合わせる
    4. 各細胞培養インサートに150 μLの希釈コラーゲンIV溶液(22.7 μg/cm2に相当)を追加します。
      注意: ピペットを透過性膜の中心に垂直に注意深く向け、コラーゲン溶液がすべての膜を覆っていることを確認します。
    5. プレートを37°C、5%CO2 インキュベーターに入れ、一晩(または最低3時間)放置します。
  3. 細胞培養インサートへの3Dオルガノイド細胞の播種
    1. ステップ4.2.1〜4.2.7に記載されているように、3Dオルガノイドから細胞懸濁液を調製します。
    2. トリパンブルーで1:2に希釈した細胞をセルカウンターでカウントし、培養インサートあたり2.5 x 10 5細胞を播種するのに必要な量を計算し、7.6 x 105細胞/cm2に相当します。
    3. 必要量の細胞懸濁液を500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
    4. 遠心分離中は、培養インサートからコーティング溶液を注意深く吸引し、蓋なしでフードの下のRTで5分間乾燥させます。
    5. 遠心分離後、上清を廃棄し、10 μM Y27632 ROCK阻害剤を添加した必要量の2D培地に細胞ペレットを再懸濁します。細胞を含む2D培地は、各インサートに200 μLの容量が必要です。
    6. 200 μLの細胞懸濁液(2.5 x 105 細胞)をコーティングされた透過膜(頂端側)上に播種します(図4A)。
      注意: 膜の中央でゆっくりとピペットをし、先端を垂直に保ちます。
    7. 10 μM Y27632 ROCK阻害剤を添加した2D培地500 μLを下部コンパートメント(基底側)に追加します。37°C、5%CO2 インキュベーターでインキュベートします。
    8. 播種の1日後に、頂端培地と基礎培地をY27632 ROCK阻害剤を含まない新鮮な2D培地と交換します。
    9. 2Dメディアは毎日交換してください。単層は播種後1日でコンフルエントになり、実験に使用できます。
      注:ブランク(細胞なしの挿入)の上の経上皮電気抵抗(TEER)値は、コンフルエンシーに達したことを確認します(図4B)。

7. オルガノイド細胞単分子膜の免疫染色

  1. 溶液の調製
    注:染色するウェルの数に応じて溶液の量を調整します。1ウェルの各ステップで200 μLの溶液が必要です。すべての商用製品への参照は、 材料表に記載されています。
    1. 35 mLのPBSに5 mLの32%PFAを加えて、化学フードの下で4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を調製します。10 mLアリコートを調製し、-20°Cで保存します。
      注意: ニトリル手袋を着用している間、常に化学フードの下でPFAを操作してください。
    2. 使用直前に2 μLのトリトンX100を1 mLのPBSに加えることにより、0.2%トリトンX100-PBSの溶液を調製します。RTにとどまります。
    3. 100 mgのBSAを1 mLのPBSに加えることにより、10%ウシ血清アルブミン(BSA)-PBS溶液を調製します。RTにとどまります。
    4. 1 mLのPBSに10 mgのBSAを加えて、1%BSA-PBS溶液を調製します。RTにとどまります。
    5. 995 μLの1% PBS BSAに5 μLの一次抗体を加えて、1:200で希釈したオクルジン一次抗体の溶液を調製します。溶液を氷の上に置いてください。
    6. 1%BSA-PBSの999 μLに1 μLの二次抗体を加えて、1:1,000に希釈した二次抗体の溶液を調製します。溶液を氷の上に保ち、光から保護します。
    7. 990 μLのPBSに1 mg/mLのTRITCを10 μL添加することにより、10 μg/mLのファロイジンTRITCの溶液を調製します。光から保護された氷の上に保管してください。
  2. 免疫染色
    注:特に明記されていない限り、すべてのインキュベーションは、ロッキングプラットフォーム(30 rpm)でゆっくりと攪拌しながら、RTで行われます。免疫染色は、細胞培養インサート内で直接行われます。
    1. 基底培地と頂端培地を取り除きます。プレートを化学フードの下に置きます。
    2. 単層をRTで200 μLのPBSで2回洗浄し、5分間インキュベートします。
    3. 細胞単層を200 μLの4%PFAでRTで固定し、RTで20分間インキュベートします。
    4. 単層をRTで200 μLのPBSで2回洗浄し、5分間インキュベートします。
      注:固定および洗浄ステップの後、単層はPBSで4°Cに1週間保持できます。
    5. PBSを除去し、200 μLの0.2%Triton X100-PBSで透過処理し、20分間インキュベートします。
    6. 単層をRTで200 μLのPBSで2回洗浄し、5分間インキュベートします。
    7. 200 μLの一次抗体溶液を1%BSA-PBS溶液に加え、ロッキングプラットフォームでゆっくりと攪拌しながら、4°Cで一晩インキュベートします。一次抗体を含まない1%BSA-PBSのみを添加することにより、陰性対照ウェルを含める。
    8. 単層をRTで200 μLのPBSで3回洗浄し、5分間インキュベートします。
    9. 200 μLの二次抗体を1%BSA-PBSに加え、光から保護された状態でRTで2時間インキュベートします。
    10. 単層をRTで200 μLのPBSで3回洗浄し、5分間インキュベートします。
    11. 200 μLのファロイジンTRITCを10 μg/mLで添加し、10分間インキュベートします。
    12. 単層をRTで200 μLのPBSで2回洗浄し、5分間インキュベートします。
    13. PBSを取り外し、メスで膜を切断します。
    14. ピンセットでメンブレンを回収し、先端側を上に向けて顕微鏡スライドの上に置きます。
    15. DAPIを添加した封入剤15 μLを1:1,000でメンブレン上に直接加えます。カバーガラスを置き、シールします。
    16. イメージングするまで、光から保護された4°Cで保管してください。

Representative Results

上記のプロトコルに従って、ブタの腸から上皮陰窩が得られ、液体窒素中での長期保存のために凍結保存される(図1および図2A)。融解後、陰窩幹細胞をECMに播種する(図2B)。クリプト構造は通常、ECMのクリプト構造が崩壊するため、このステップの後に失われます。オルガノイドは3〜4日以内に観察され、その後急速に成長し、出芽構造を発達させます(図2B)。凍結した陰窩を解凍した後、>80%の試行でオルガノイドを取得することに成功しました。解凍の約10日後(オルガノイドの増殖速度に応じて)、オルガノイドの継代を行い、培養を拡大します(図3)。オルガノイドは分裂後により速く成長し、多様な形態を示し、いくつかの嚢胞性オルガノイドと大部分の出芽オルガノイドがあります。培養を最適に維持するために、継代に使用されるオルガノイドは、成熟オルガノイドで観察されるように、内腔に黒い破片がない(赤い矢印で示されている)明確で空の内腔と明確に定義されたエッジ(緑色の矢印で示されている例)を提示する必要があります(図3)。我々は、黒血球の破片が継代後6日目頃に蓄積し始めることを発見した。したがって、継代後4〜5日目にオルガノイドを分割または凍結することが推奨されます。

オルガノイドの成熟段階も細胞単層を得る上で重要なポイントです。成熟度が進んだオルガノイド(内腔内の黒い細胞の破片の存在によって示される)は、単層を播種するのに最適ではありません。通常、継代の4日後に3Dオルガノイドを解離し、2D培養用の細胞を回収します。ECMの50 μLドームあたり3,000細胞で培養された約1〜3ウェルの3Dオルガノイドは、2.5 x 105 細胞を1つの培養インサートに播種する必要があります。細胞は1日以内に付着して完全にコンフルエントな単層を形成し(図4A)、これは約700 Ω・cm2 の高いTEERによって確認されます(図4B)。しかし、細胞エッジは、おそらく分化レベルが低いため、この初期の時点で明視野顕微鏡で視覚化することは困難です。TEERは3日間高いままです(図4B)。

アクチン染色は、上皮細胞の頂端側が3Dオルガノイドの内腔に向いていることを示す(図5A)。培養インサートに播種されたオルガノイド細胞は、上皮細胞のコンフルエントな単層を形成し、頂端側は上部コンパートメントに向けられています(図4B、C)。オクルージン染色により、3Dオルガノイドおよび細胞単層の上皮細胞の頂端側にタイトジャンクションが存在することが明らかになりました(図5A-C)。

Figure 1
図1:オルガノイド由来の3Dオルガノイドおよび細胞単分子膜の培養に用いた方法の概略図。 上皮陰窩は子豚の腸から単離されています。これらの陰窩は、i)3Dオルガノイドの培養に直ちに使用するか、ii)凍結して液体窒素中のバイオバンクに保存することができます。凍結保存された陰窩は解凍して、3Dオルガノイドの培養に使用できます。3Dオルガノイド培養は、連続分割で維持することも、凍結してバイオバンクに保存することもできます。細胞単層は、細胞の頂端側へのアクセスを可能にし、上皮バリア機能を研究するために、3Dオルガノイド培養から得ることができる。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:凍結保存された上皮陰窩からのブタ腸3Dオルガノイドの培養。 (A)新たに単離された空腸陰窩の代表的な顕微鏡画像。(B)空腸陰窩の融解後に得られた3Dオルガノイドの代表的な顕微鏡画像。オルガノイドは、48ウェルプレート中のECMの25 μLドームで培養しました。図は、播種後4、7、8、9、および10日後の3Dオルガノイドの画像を示しています。スケールバーは500μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:最初の継代後の凍結保存された上皮陰窩に由来するブタ腸3Dオルガノイドの形態。 4日目から7日目までの最初の継代後の凍結保存された空腸陰窩に由来するオルガノイドの発達を示す代表的な顕微鏡画像。緑色の矢印は、単層の通過または播種に適した透明なオルガノイドを示す。赤い矢印は、単層の分割または播種に適さない成熟オルガノイドを示します。したがって、ウェルはこの形態の出現の前に使用されるべきです。スケールバーは500μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:ブタ腸管3Dオルガノイド由来の細胞単分子膜の特徴。 (a)3日間にわたる単層形態の代表的な顕微鏡像。空腸オルガノイド細胞を、コラーゲンIVを50 ng/mLでコーティングした0.33 cm 2細胞培養インサートに2.5 x 105細胞で播種しました。スケールバーは500μmを表す。 (B)3日間にわたるオルガノイド細胞単層の経上皮電気抵抗(TEER)。線で結ばれた点は、異なる時間に同じウェルに対応しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:3Dまたは2Dで培養したブタ空腸オルガノイドのイメージング。(A)分裂後5日目の3Dオルガノイドおよび(B,C)播種後3日目のオルガノイド細胞単層の共焦点顕微鏡イメージング(B:XZセクション;C:XYセクション)。DNA(青色)をDAPIで染色した。アクチン(赤色)はファロイジンで染色した。オクルジン(緑色)をポリクローナル抗体で染色した。白い矢印は、タイトジャンクションに局在するオクルジンを示す。スケールバーは20μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

このプロトコルは、3Dオルガノイドの長期保存およびその後の培養のために、子豚の腸からの上皮陰窩を凍結保存するために使用される方法について説明しています。このプロトコルは、DMSO、FBS、Y27632 ROCK阻害剤、DMEM、および抗生物質を含む凍結溶液を使用します。ブタにおける別の研究では、同様の凍結溶液中で凍結保存された陰窩からオルガノイドを得たが、ROCK阻害剤は含まれていない15。Y27632 ROCK阻害剤は、融解後に上皮陰窩細胞が解離し、細胞死(「anoikis」)につながる可能性があるため、アポトーシスを防ぎ、幹細胞プールを維持するために含まれていました27,28。興味深いことに、ウマエンテロイドは、DMEMとDMSO16のみを含む培地で凍結された上皮陰窩から得られました。この簡単な方法は、ブタの上皮陰窩についてまだテストされていません。上皮陰窩の代わりに凍結組織または生検からヒトおよびブタオルガノイドを増殖させる他の方法が発表されている4,17。この方法の利点は、時間と実験装置を必要とする陰窩分離手順を実行せずに腸組織を直接凍結保存できることです。これは、組織をラボから遠く離れた場所に収集する必要がある場合に便利です。しかしながら、屠殺直後に陰窩を単離する場合、腸の大きな部分を処理して非常に多数の陰窩を得ることができるが、これは小さな凍結組織片から始める場合には当てはまらない。上皮陰窩の融解後、播種後3〜4日でオルガノイドが観察され、10日後に分裂した。これは、播種後1日目からオルガノイドが得られた新鮮な上皮陰窩から培養を開始する場合よりも遅い増殖速度であり、通常、5日目から11日目頃に分割できます。Khalilらはまた、凍結した陰窩から開始するとブタのエンテロイドの成長が遅れることを報告し15、幹細胞が増殖能力を回復するのに時間がかかる可能性があることを示唆しています。また、凍結クリプトから開始した場合、新鮮なクリプトと比較してオルガノイドの数が少なくなりましたが、これは凍結プロセス中の幹細胞の死が原因である可能性があります。陰窩融解のいくつかの試み(<20%)では、おそらく最適ではない凍結保存手順(例えば、おそらく1時間以上の陰窩分離後の凍結の遅延)のために、凍結陰窩からオルガノイドを取得しませんでした。したがって、カウントするまで地下室を氷上に保ち、できるだけ早く凍結することをお勧めします。

3Dオルガノイドについては、ヒト用に製剤化された市販のオルガノイド培養培地を使用することを選択しました。実際、以前の報告では、ブタの腸管オルガノイドがこの培地で効率的に増殖することが示されています8、11、14、19、25、26、29、30。この培地がすぐに使用でき、バッチ内の成長因子の濃度が標準化されていることは重要です。しかしながら、この培地は高価であり、その組成は開示されておらず、したがってその組成を調節することはできない。対照的に、他の研究では、薬理学的阻害剤、組換え成長因子、および/または馴化培地を含むカスタマイズされた培地でブタ腸オルガノイドを培養しています5、6、7、21。この方法は柔軟性が高く安価ですが、馴化培地の製造には時間がかかり、馴化培地中の成長因子の濃度にばらつきが生じる可能性があるため、再現性に欠ける可能性があります。したがって、馴化培地の各バッチの品質は、オルガノイド増殖またはマーカー遺伝子発現を測定することによって検証されるべきである31。

ある研究によると、ここで使用されているのと同じ市販のオルガノイド培養培地で培養されたブタ空腸オルガノイドは、組換え成長因子および/または馴化培地を含む培地で培養されたエンテロイドと比較して、より速く成長し、分化が少ないように見えました23。高増殖状態は3Dオルガノイドの培養を容易にするが、腸の生理学的特性をより代表するために分化誘導を必要とするかもしれない。このプロトコルでは、3Dオルガノイドの通過のために、細胞は計数のために完全に解離され、ECMに播種される細胞の数を制御することができます。これにより、オルガノイドの表現型の再現性が高まり、その密度に大きく影響されます。さらに、細胞を数えることは、低すぎるまたは過密な培養を得ることを回避し、それは培養スケジュールを適応させることを必要とする。他のほとんどの研究では、単一細胞に完全に解離していないオルガノイド断片を調製し、継代に希釈比を使用しました。この方法はより単純ですが、培養物のオルガノイド密度に応じて変動を誘発する可能性があります。

単層培養では、ECMの薄層でプレコートされた培養インサートにオルガノイド細胞を播種し、細胞の付着を可能にしますが、3Dでのオルガノイドの増殖を回避します。このプロトコルは、ブタ23で前述したように、ECMタンパク質としてコラーゲンIV型を使用した。ブタオルガノイド単分子膜を用いた他の研究では、ここで使用したのと同じ腫瘍由来ECMを使用して3Dオルガノイドを培養しました6、8、9、21、25、30。コラーゲンを使用する利点は、完全に定義された組成でタンパク質濃度を標準化できることですが、これは腫瘍由来ECMには当てはまりません。細胞単層の培養を成功させるための重要なステップは、明確なエッジと黒い破片のない空の内腔を持つべき前駆体3Dオルガノイドの視覚的外観に注意を払うことです。実際、成熟レベルが高く増殖速度が低いオルガノイドは、2D培養に適した細胞源ではありません。したがって、3Dオルガノイドを単一細胞に解離するタイミングは、このステップの成功にとって非常に重要です。

単一細胞からの2D単分子膜の培養は、播種される細胞の数を標準化することを可能にするが、これは他のいくつかの方法で行われるように、オルガノイド断片から始める場合により困難である。7.6 x 10 5細胞/cm 2を播種したが、これは、0.25 x 105細胞/cm2から1.78 x 105細胞/cm 2の範囲のより低い細胞密度を使用したブタにおいて、他のほとんどの研究21,22,23と比較して高い。多数のオルガノイド細胞を必要とすることがこのプロトコルの制限となりますが、1日後に培養インサートを完全に覆うコンフルエント単層を迅速に得ることができました。対照的に、Vermeireら23は、播種された細胞の密度が低い(0.25 x 10 5細胞/cm 2から0.4 x 105細胞/cm2)4〜7日後にコンフルエント性を得た。いくつかの研究では、ウイルス感染のために培養表面を完全に覆っていないブタオルガノイド細胞単層も使用しています8,30。これらの条件では、上皮細胞の頂端側は治療のためにアクセス可能ですが、目的が栄養素吸収または上皮透過性を研究することであるならば、完全にコンフルエントな単層が必要です。

オルガノイド細胞単層については、ウシエンテロイド由来単分子膜に関する最近の研究に基づいて、20%FBSを添加した市販のオルガノイド培養培地を使用した32。我々の試験では、完全にコンフルエントな単層を得るために20%FBSの補給が必要であったが、これはおそらく高い成長因子要件のためであった。それどころか、同じ市販培地を使用する他の研究では、追加のFBS8、25、30なしで単層が確立されていますが、完全なコンフルエントに達することはありません。他の研究でも、ブタオルガノイド細胞単層の培養用にカスタマイズされた培地に20%FBSを補給して使用しています21,22。我々の実験では、TEERは播種後1日目(約700 Ω・cm 2)高く、3日目まで高いまま(約1,500 Ω・cm2;これは、オクルジンの発現によって示されるように、タイトジャンクションの形成と一致している。Van der Heeらは、空腸オルガノイド細胞単層について72時間にわたって同様のTEER値を得た21。彼らはまた、単層が毎日の培地交換で12〜15日目まで維持できることを実証した。対照的に、他の研究では、ブタオルガノイド細胞単層についてはるかに低いTEER値(約200 Ω・cm2)が報告されています6,22。研究間のこれらの違いは、研究された腸セグメントまたは上皮分化に影響を与えるために使用される培地に関連している可能性があります。

結論として、凍結上皮陰窩からブタ腸3Dオルガノイドを増殖させる上記のプロトコールは、培養作業の組織化を容易にする。それは生きている動物から新鮮な組織を得る必要性を減らします。また、ブタオルガノイド由来の完全コンフルエントな細胞単分子膜を3日以内に樹立する方法についても説明します。したがって、私たちのプロトコルは、獣医学または生物医学研究のためにブタ腸上皮を研究する科学者にとって有用なリソースになる可能性があります。

Disclosures

著者は開示するものは何もありません。

Acknowledgments

この研究は、Institut Carnot France Futur Elevage(「OrganoPig」プロジェクト)とINRAE HOLOFLUX(「Holopig」プロジェクト)の支援を受けました。著者らは、ジェノトール中核施設(TRI)に感謝しています。私たちは、Christelle Knudsen(GenPhySE、INRAE、トゥールーズ)の慎重な校正に感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9260G Store at room temperature.
15 mL conical tube Sarstedt 62.554.502
24-well cell culture plate Corning 003526
48-well cell culture plate Corning 003548
50 mL polypropylene conical tube Falcon 352070
Bovine Serum Albumine (BSA) Euromedex A6003 Store at 4 °C.
Centrifuge Universal 320 R Hettich 1406
Collagene type IV from human placenta Sigma C5533 Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (500 µL) and store at -20 °C.
CoolCell LX Cell Freezing Container Corning 432003 Used to cryopreserve crypts and organoids.
Countess 3 Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific 16842556
Coverslips, 22 mm x 50 mm VWR 630-1845
Cryotube ClearLine 1 mL Clear line 390706 Used to cryopreserve crypts and organoids.
DAPI Invitrogen D1306 Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer’s recommendation. Aliquot (20 µL) and store at -20 °C
Dithiothreitol (DTT) Merck 10197777001 Store at 4 °C.
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 31966047 Store at 4 °C.
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Corning 25-950-CQC Store at room temperature.
Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide VWR 631-9483
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 10270-106 Store 5 mL aliquots at -20 °C.
Fisherbrand Sterile Cell Strainers Thermo Fisher Scientific 22363549 Used for crypt isolation.
Fixed Tilt 3D Platform Rotator VWR 97025-564 Used for incubations in the immunostaining protocol.
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010015 Store at 4 °C.
Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red Thermo Fisher Scientific 12605-010 Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.
Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008 Secondary antibody. Store at 4 °C. Working dilution 1:1000.
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) Stem Cell Technology 6010 Organoid culture medium. Store at -20 °C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 °C for up to 1 week.
Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells Corning 353095
Inverted microscope Nikon Eclipse TS2
Matrigel Basement Membrane Matrix Corning 354234 Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 µL aliquots and store at -20 °C.
Mounting medium for fluorescence with DAPI Vectashield H1250 Store at 4 °C.
Occludin polyclonal antibody Thermo Fisher Scientific 71-1500 Primary antibody. Store at -20 °C. Working dilution 1:200.
Paraformaldehyde 32% Electron microscopy science 15714 Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 °C.
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333 Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 °C.
Phalloidin TRITC Sigma P1951 Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 °C.
Primocin InvivoGen ant-pm-05 Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 °C.
ROCK Inhibitor (Y27632) ATCC ACS-3030 Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer's recommendation and store aliquots (50 µL) at -20 °C.
Rotating shaker mix XL Clear line 062646CL Used for crypt isolation.
Stripette Serological Pipets 10 mL Corning 4488
Tissue Culture Dish TPP 93100
Triton X100 Sigma 8787 Store at room temperature.
Trypan Blue stain 0.4% Thermo Fisher Scientific T10282 Store at room temperature.
Vacuum system Vacusip Integra 159000 Used to remove the medium of organoid wells.

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生物学、第192号、
凍結保存された上皮陰窩からの子豚腸3Dオルガノイドの培養と細胞単分子膜の樹立
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Mussard, E., Lencina, C., Boudry,… More

Mussard, E., Lencina, C., Boudry, G., Achard, C. S., Klotz, C., Combes, S., Beaumont, M. Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers. J. Vis. Exp. (192), e64917, doi:10.3791/64917 (2023).

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