يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء تحرير فعال لقاعدة الأدينين دون قيود PAM لبناء نموذج دقيق لمرض الزرد باستخدام zSpRY-ABE8e.
زادت تقنية CRISPR / Cas9 من قيمة أسماك الزرد لنمذجة الأمراض الوراثية البشرية ، ودراسة التسبب في الأمراض ، وفحص الأدوية ، لكن قيود الشكل المجاور للفضاء الأولي (PAM) تشكل عقبة رئيسية أمام إنشاء نماذج حيوانية دقيقة للاضطرابات الوراثية البشرية الناجمة عن متغيرات النوكليوتيدات المفردة (SNVs). حتى الآن ، أظهرت بعض متغيرات SpCas9 ذات التوافق الواسع مع PAM كفاءة في الزرد. أتاح تطبيق محرر قاعدة الأدينين المحسن بوساطة SpRY (ABE) ، zSpRY-ABE8e ، و gRNA المعدل صناعيا في الزرد تحويل قاعدة الأدينين والجوانين بكفاءة دون قيود PAM. الموصوف هنا هو بروتوكول لتحرير قاعدة الأدينين بكفاءة دون قيود PAM في الزرد باستخدام zSpRY-ABE8e. عن طريق حقن خليط من zSpRY-ABE8e mRNA و gRNA المعدل صناعيا في أجنة الزرد ، تم بناء نموذج مرض الزرد مع طفرة دقيقة تحاكي موقعا مسببا للأمراض لعامل نضج الريبوسوم TSR2 (tsr2). توفر هذه الطريقة أداة قيمة لإنشاء نماذج دقيقة للأمراض لدراسة آليات المرض والعلاجات.
المتغيرات أحادية النوكليوتيدات (SNVs) التي تسبب طفرات خاطئة أو هراء هي المصدر الأكثر شيوعا للطفرات في الجينوم البشري1. لتحديد ما إذا كان SNV معين مسببا للأمراض ، ولإلقاء الضوء على التسبب فيه ، هناك حاجة إلى نماذج حيوانية دقيقة2. الزرد هي نماذج جيدة للأمراض البشرية ، وتظهر درجة عالية من التماثل الفسيولوجي والجيني مع البشر ، ودورة نمو قصيرة ، وقدرة إنجابية قوية ، وهو أمر مفيد للبحث في الخصائص والآليات المسببة للأمراض ، وكذلك فحص الأدوية3.
تم تطبيق نظام التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) / Cas9 على نطاق واسع في تحرير الجينوم لمختلف الأنواع ، بما في ذلك الزرد4. مع توجيه gRNA ، يمكن لنظام CRISPR / Cas9 توليد فواصل مزدوجة تقطعت بهم السبل (DSBs) في الموقع المستهدف ، والتي تسمح بعد ذلك باستبدال قاعدة واحدة من خلال إعادة تركيب الموقع المستهدف مع قوالب الحمض النووي للمتبرع عبر مسار الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR). ومع ذلك ، فإن كفاءة طريقة استبدال القاعدة هذه منخفضة جدا حيث يتم تنفيذ عملية إصلاح الحمض النووي الخلوي بشكل أساسي من خلال مسار الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) ، والذي عادة ما يكون مصحوبا بطفرات الإدراج والحذف (indel)5. لحسن الحظ ، تعمل تقنية التحرير أحادية القاعدة المستندة إلى CRISPR / Cas9 على تخفيف هذه المشكلة بشكل كبير باستخدام برامج التحرير الأساسية ، والتي تتيح تحريرا أكثر كفاءة لقاعدة واحدة دون حث DSBs. تم تطوير فئتين رئيسيتين من المحررين الأساسيين ، محرري قاعدة الأدينين (ABEs) ومحرري قاعدة السيتوزين (CBEs) ، لتنفيذ تحرير استبدال القاعدة ل A · تي إلى ز· C و C · G إلى T · أ ، على التوالي6،7،8،9،10،11. تغطي هذه الأنواع الأربعة من بدائل القاعدة 30٪ من المتغيرات المسببة للأمراض البشرية12. تم الإبلاغ عن أن كلا الفئتين من المحررين الأساسيين ، بما في ذلك PmCDA1 ونظام BE و CBE4max و ABE7.10 و ABE8e ، يعملان في الزرد ، مع الإبلاغ عن BE4max و ABE8e بشكل خاص لتحقيق نشاط تحرير مرتفع 13،14،15،16،17،18،19.
تم تنفيذ بروتينات Cas9 من أنواع مختلفة ، بما في ذلك المكورات العنقودية الذهبية ، والمكورات العقدية المقيحة ، و S. canis ، في تحرير جينات الزرد ، مع استخدام العقدية المقيحة Cas9 (SpCas9) على نطاق واسع20،21،22،23. ومع ذلك ، يمكن ل SpCas9 التعرف فقط على المواقع المستهدفة ذات الشكل المجاور ل NGG protospacer (PAM) ، مما يحد من نطاقه القابل للتحرير ويمكن أن يؤدي إلى عدم العثور على تسلسل مناسب بالقرب من الموقع الممرض محل الاهتمام24. لتوسيع النطاق المستهدف ، تم تصميم مجموعة متنوعة من متغيرات SpCas9 للتعرف على PAMs المختلفة من خلال التطور الموجه والتصميم الموجه بالهيكل. ومع ذلك ، فإن القليل من المتغيرات فعالة في الحيوانات ، وخاصة في الزرد ، مما يحد من تطبيق الزرد في أبحاث الأمراض المرتبطة ب SNV25،26،27،28. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن نوعين مختلفين من SpCas9 و SpG و SpRY ، مع قيود PAM أقل صرامة (NGN ل SpG و NNN ل SpRY مع تفضيل أعلى ل NRN من NYN) لإظهار نشاط تحرير عالي في الخلايا البشرية والنباتات29،30،31،32. بعد ذلك ، تم الإبلاغ أيضا عن SpG و SpRY ، بالإضافة إلى عدد من محرري القاعدة بوساطة ، مثل CBEs بوساطة SpRY و ABEs بوساطة SpRY ، للعمل في الزرد ، مما سيعزز تطبيق نماذج الزرد في الدراسة الميكانيكية وفحص الأدوية للأمراض المرتبطة ب SNV18،33،34،35. علاوة على ذلك ، تم اقتراح i-Silence كاستراتيجية فعالة ودقيقة للضربة القاضية الجينية من خلال تحويل كودون البدء بوساطة ABE من ATG إلى GTG أو ACG36. يوفر الجمع بين استراتيجية i-Silence والمحرر الأساسي بوساطة SpRY zSpRY-ABE8e طريقة جديدة لنمذجة الأمراض18. يوضح هذا البروتوكول كيفية إجراء تحرير الجينات باستخدام zSpRY-ABE8e في الزرد لبناء نموذج tsr2 (M1V) باستخدام استراتيجية i-Silence. تم تقييم وتحليل كفاءة التحرير والأنماط الظاهرية التي تظهر في نماذج الزرد.
يصف هذا البروتوكول بناء نموذج مرض الزرد باستخدام المحرر الأساسي zSpRY-ABE8e. بالمقارنة مع مسار HDR التقليدي لاستبدال القاعدة ، يمكن لهذا البروتوكول تحقيق تحرير أساسي أكثر كفاءة وتقليل حدوث indels. في الوقت نفسه ، يتضمن هذا البروتوكول تنفيذ استراتيجية الضربة القاضية الجينية i-Silence المقترحة مؤخرا في…
The authors have nothing to disclose.
نشكر باربرا جاربرز ، دكتوراه ، من Liwen Bianji (Edanz) لتحرير النص الإنجليزي لمسودة هذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحث والتطوير في المنطقة الرئيسية لمقاطعة قوانغدونغ (2019B030335001) ، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2019YFE0106700) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32070819 ، 31970782) ، وبرنامج صندوق البحوث في مختبر مقاطعة قوانغدونغ الرئيسي للبيولوجيا المسببة للأمراض وعلم الأوبئة للحيوانات الاقتصادية المائية (PBEA2020YB05).
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
mMACHINE kit | |||
Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |