Préparation de matrices décellularisées 3D à partir de muscle squelettique de souris fœtale pour culture cellulaire
Summary
Dans ce travail, un protocole de décellularisation a été optimisé pour obtenir des matrices décellularisées du muscle squelettique de souris fœtale. Les myoblastes C2C12 peuvent coloniser ces matrices, proliférer et se différencier. Ce modèle in vitro peut être utilisé pour étudier le comportement cellulaire dans le contexte de maladies musculaires squelettiques telles que les dystrophies musculaires.
Abstract
La matrice extracellulaire (ECM) joue un rôle crucial en fournissant un soutien structurel aux cellules et en transmettant des signaux importants pour divers processus cellulaires. Les modèles de culture cellulaire bidimensionnels (2D) simplifient à l’excès les interactions complexes entre les cellules et l’ECM, car l’absence d’un support tridimensionnel complet (3D) peut modifier le comportement cellulaire, les rendant inadéquats pour comprendre les processus in vivo . Les déficiences dans la composition de l’ECM et les interactions cellule-ECM sont des contributeurs importants à une variété de maladies différentes.
Un exemple est la dystrophie musculaire congénitale LAMA2 (LAMA2-CMD), où l’absence ou la réduction de la laminine fonctionnelle 211 et 221 peut entraîner une hypotonie sévère, détectable à la naissance ou peu après. Des travaux antérieurs utilisant un modèle murin de la maladie suggèrent que son apparition se produit pendant la myogenèse fœtale. La présente étude visait à développer un modèle 3D in vitro permettant l’étude des interactions entre les cellules musculaires et l’ECM du muscle fœtal, imitant le microenvironnement natif. Ce protocole utilise des muscles profonds du dos disséqués à partir de fœtus de souris E18.5, traités avec un tampon hypotonique, un détergent anionique et de la DNase. Les matrices décellularisées résultantes (dECM) ont conservé toutes les protéines ECM testées (laminine α2, laminines totales, fibronectine, collagène I et collagène IV) par rapport au tissu natif.
Lorsque les myoblastes C2C12 ont été ensemencés au-dessus de ces dECM, ils ont pénétré et colonisé les dECM, ce qui a favorisé leur prolifération et leur différenciation. De plus, les cellules C2C12 ont produit des protéines ECM, contribuant au remodelage de leur niche au sein des dECM. La mise en place de cette plateforme in vitro fournit une nouvelle approche prometteuse pour démêler les processus impliqués dans l’apparition de LAMA2-CMD, et a le potentiel d’être adaptée à d’autres maladies musculaires squelettiques où des déficiences dans la communication entre l’ECM et les cellules musculaires squelettiques contribuent à la progression de la maladie.
Introduction
La matrice extracellulaire (MEC) est un constituant majeur des tissus, représentant leur composante non cellulaire. Cette structure tridimensionnelle (3D) fournit non seulement un soutien physique aux cellules, mais joue également un rôle crucial dans les processus biochimiques impliqués dans le développement des organismes1. La formation d’une ECM spécifique au tissu se produit au cours du développement, en raison des interactions complexes entre les cellules et leurs niches, influencées par divers stimuli intra et extracellulaires. L’ECM est une structure très dynamique qui subit des réarrangements chimiques et mécaniques de manière temporelle et spatiale et a un impact direct sur le destin cellulaire2. L’une des caractéristiques les plus remarquables de l’ECM est sa diversité fonctionnelle, car chaque ECM tissulaire présente une combinaison unique de molécules qui fournissent différentes topologies et propriétés adaptées aux cellules qu’il contient1.
La signalisation et le soutien de l’ECM sont cruciaux pour le développement et l’homéostasie et, lorsqu’ils sont perturbés, ils peuvent entraîner de multiples pathologies 3,4. Un exemple est la dystrophie congénitale déficiente en LAMA2 (LAMA2-CMD), qui est la forme la plus courante de dystrophie musculaire congénitale. Le gène LAMA2 code pour la chaîne de laminine α2, qui est présente dans la laminine 211 et la laminine 221, et lorsqu’elle est mutée, peut conduire à LAMA2-CMD 5. La laminine 211 est la principale isoforme trouvée dans la membrane basale entourant les fibres musculaires squelettiques. Lorsque la laminine 211 est anormale ou absente, le lien entre la membrane basale et les cellules musculaires est perturbé, entraînant l’apparition de la maladie6. Les patients atteints de LAMA2-CMD présentent un phénotype léger à sévère en fonction du type de mutation dans le gène LAMA2.
Lorsque la fonction de la protéine laminine α2 est affectée, les patients peuvent présenter une hypotonie musculaire sévère à la naissance et développer une inflammation chronique, une fibrose et une atrophie musculaire, entraînant une réduction de l’espérance de vie. À ce jour, aucun traitement ciblé n’a été développé et les approches thérapeutiques se limitent à soulager les symptômes de la maladie7. Par conséquent, la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents impliqués dans l’apparition de cette maladie est cruciale pour développer des stratégies thérapeutiques appropriées 6,8. Des travaux antérieurs utilisant la souris dyW 9, un modèle pour LAMA2-CMD, suggèrent que l’apparition de la maladie commence in utero, en particulier pendant la myogenèse fœtale10. Une meilleure compréhension de la façon dont le défaut de myogenèse fœtale émerge changerait la donne dans la génération de nouvelles approches thérapeutiques pour LAMA2-CMD.
Les systèmes in vitro fournissent un environnement contrôlé pour étudier les interactions cellule-cellule et cellule-ECM, mais les modèles de culture 2D n’ont pas la complexité des tissus natifs. La décellularisation des tissus produit des échafaudages ECM acellulaires spécifiques aux tissus et aux stades de développement qui imitent plus précisément le microenvironnement cellulaire naturel par rapport aux modèles 2D et aux échafaudages artificiels / synthétiques. Les matrices décellularisées (dECM) ont le potentiel de préserver les signaux moléculaires et mécaniques du tissu hôte, ce qui en fait de meilleurs modèles alternatifs pour comprendre les processus in vivo 11.
Il existe diverses techniques, réactifs et conditions qui peuvent être utilisés pour la décellularisation12,13. Dans cette étude, un protocole de décellularisation pour le cœur de souris fœtale, décrit par Silva et al.14,15, est adapté au muscle squelettique de souris fœtale et conserve tous les composants ECM testés (laminine α2, laminines totales, fibronectine, collagène I et collagène IV). Le protocole comprend trois étapes : la lyse cellulaire par choc osmotique (tampon hypotonique), la dissolution de la membrane plasmique et la dissociation des protéines (dodécylsulfate de sodium à 0,05 % [SDS]), et la destruction enzymatique de l’ADN (traitement par DNase). À notre connaissance, il s’agit du premier protocole établi pour décellulariser le muscle squelettique fœtal de souris.
Pour utiliser ce système 3D in vitro pour étudier LAMA2-CMD, il est crucial de maintenir la chaîne laminine α2 après décellularisation. Par conséquent, un protocole d’optimisation a été mis en œuvre où différents détergents (FDS et Triton X-100) et concentrations (0,02 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,2 % et 0,5 %) ont été testés (données non présentées). Le choix optimal pour l’élimination cellulaire et la préservation de la protéine laminine α2 s’est avéré être 0,05% SDS. Les cellules C2C12, une lignée cellulaire de myoblastes16,17 bien établie, ont été utilisées pour ensemencer les dECM. Ces cellules envahissent la dECM, prolifèrent et se différencient à l’intérieur de ces échafaudages, synthétisant de nouvelles protéines ECM. La production réussie de ce modèle in vitro 3D offre une nouvelle approche pour comprendre les processus moléculaires et cellulaires impliqués dans la myogenèse fœtale, l’apparition de LAMA2-CMD, et peut être étendue à d’autres maladies musculaires où la communication entre l’ECM et les cellules musculaires squelettiques est perturbée.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ECM est un réseau complexe de macromolécules présent dans tous les tissus et jouant un rôle crucial dans la régulation du comportement et de la fonctioncellulaire 2. L’ECM agit comme un échafaudage physique auquel les cellules peuvent se fixer et fournit des indices qui modulent activement les processus cellulaires tels que la prolifération, la motilité, la différenciation et l’apoptose. Ainsi, la formation et le maintien appropriés de l’ECM sont essentiels à la fois pour le d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par l’Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon ; contrat n° 23049), le projet MATRIHEALTH, et l’unité cE3c de financement UIDB/00329/2020. Nous tenons à remercier notre donateur Henrique Meirelles qui a choisi de soutenir le projet MATRIHEALTH. Ce travail a bénéficié des infrastructures de l’installation de microscopie de la Faculté des sciences, un nœud de la plate-forme portugaise de bioimagerie (référence PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), et nous remercions Luís Marques pour son aide dans l’acquisition et le traitement des images. Enfin, nous remercions Marta Palma pour son soutien technique et notre équipe de recherche pour leurs généreuses contributions.
Materials
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
Referências
- Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
- Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
- Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l’Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
- van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
- Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
- Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
- McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
- Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
- Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
- Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -. A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
- Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
- Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
- Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).
