細胞培養のためのマウス胎児骨格筋からの3D脱細胞化マトリックスの調製
Summary
この研究では、脱細胞化プロトコルを最適化して、マウス胎児骨格筋の脱細胞化マトリックスを取得しました。C2C12筋芽細胞は、これらのマトリックスにコロニーを形成し、増殖し、分化することができます。この in vitro モデルは、筋ジストロフィーなどの骨格筋疾患の状況における細胞の挙動を研究するために使用できます。
Abstract
細胞外マトリックス(ECM)は、細胞の構造的サポートを提供し、さまざまな細胞プロセスに重要なシグナルを伝達する上で重要な役割を果たします。2次元(2D)細胞培養モデルは、完全な3次元(3D)サポートがないため、細胞の挙動が変化し、 in vivo プロセスの理解に不十分になるため、細胞とECMの間の複雑な相互作用を単純化しすぎます。ECM組成と細胞-ECM相互作用の欠損は、さまざまな異なる疾患の重要な原因です。
一例はLAMA2-先天性筋ジストロフィー(LAMA2-CMD)であり、機能的なラミニン211および221の不在または減少は、出生時または出生直後に検出可能な重度の低張症につながる可能性があります。この疾患のマウスモデルを用いた以前の研究は、その発症が胎児の筋形成中に起こることを示唆している。本研究は、筋肉細胞と胎児の筋肉ECMとの間の相互作用の研究を可能にする3D インビトロ モデルを開発することを目的としており、ネイティブの微小環境を模倣しています。このプロトコルは、E18.5マウス胎児から解剖し、低張緩衝液、陰イオン界面活性剤、およびDNaseで処理した深部背筋を使用します。得られた脱細胞化マトリックス(dECM)は、天然組織と比較して、テストされたすべてのECMタンパク質(ラミニンα2、総ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンI、およびコラーゲンIV)を保持していました。
C2C12筋芽細胞がこれらのdECMの上に播種されると、それらはdECMに浸透してコロニーを形成し、増殖と分化をサポートしました。さらに、C2C12細胞はECMタンパク質を産生し、dECM内のニッチのリモデリングに寄与した。この in vitro プラットフォームの確立は、LAMA2-CMDの発症に関与するプロセスを解明するための新しい有望なアプローチを提供し、ECMと骨格筋細胞間のコミュニケーションの欠陥が疾患の進行に寄与する他の骨格筋疾患に適応する可能性があります。
Introduction
細胞外マトリックス(ECM)は、組織の主要な構成要素であり、それらの非細胞成分を表す。この3次元(3D)構造は、細胞を物理的にサポートするだけでなく、生物の発生に関与する生化学的プロセスにおいても重要な役割を果たします1。組織特異的ECMの形成は、細胞とそれらのニッチとの間の複雑な相互作用の結果として、様々な細胞内および細胞外の刺激の影響を受ける発生中に起こる。ECMは、時間空間的に化学的および機械的再配列を起こし、細胞の運命に直接影響を与える非常に動的な構造です2。ECMの最も顕著な特徴の1つは、各組織ECMが、それに含まれる細胞に合わせた異なるトポロジーおよび特性を提供する分子の固有の組み合わせを示すため、その機能の多様性である1。
ECMシグナル伝達とサポートは、発生と恒常性に不可欠であり、破壊されると複数の病理学的状態につながる可能性があります3,4。一例は、先天性筋ジストロフィーの最も一般的な形態であるLAMA2欠損先天性ジストロフィー(LAMA2-CMD)です。LAMA2遺伝子は、ラミニン211およびラミニン221に存在するラミニンα2鎖をコードし、変異するとLAMA2-CMD5につながる可能性があります。ラミニン211は、骨格筋線維を取り囲む基底膜に見られる主要なアイソフォームです。ラミニン211が異常または不在の場合、基底膜と筋細胞との間のリンクが破壊され、疾患の発症につながる6。LAMA2-CMDの患者は、LAMA2遺伝子の突然変異の種類に応じて軽度から重度の表現型を示します。
ラミニンα2タンパク質の機能に影響を与えると、患者は出生時に重度の筋緊張低下を経験し、慢性炎症、線維症、筋萎縮を発症し、平均余命を縮める可能性があります。今日まで、標的療法は開発されておらず、治療アプローチは病気の症状を緩和することに限定されています7。したがって、この病気の発症に関与する根本的な分子メカニズムを理解することは、適切な治療戦略を開発するために重要です6,8。LAMA2-CMDのモデルであるdyWマウス9を用いた以前の研究では、この病気の発症は子宮内、特に胎児の筋形成10の間に始まることが示唆されています。胎児の筋形成障害がどのように現れるかをよりよく理解することは、LAMA2-CMDの新しい治療アプローチを生み出す上でのゲームチェンジャーとなるでしょう。
in vitro システムは、細胞-細胞および細胞-ECM相互作用を研究するための制御された環境を提供しますが、2D培養モデルにはネイティブ組織の複雑さが欠けています。組織の脱細胞化により、2Dモデルや人工/合成足場と比較して、自然の細胞微小環境をより正確に模倣する組織および発生段階特異的な無細胞ECM足場が生成されます。脱細胞化マトリックス(dECM)は、宿主組織の分子的および機械的手がかりを保存する可能性があり、 in vivo プロセスを理解するためのより良い代替モデルになります11。
脱細胞化に使用できる様々な技術、試薬、および条件がある12、13。この研究では、Silvaら14,15によって記述された胎児マウス心臓の脱細胞化プロトコルがマウス胎児骨格筋に適合し、テストされたすべてのECM成分(ラミニンα2、総ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンI、およびコラーゲンIV)を保持することが判明しました。このプロトコルには、浸透圧ショックによる細胞溶解(低張緩衝液)、原形質膜溶解およびタンパク質解離(0.05%ドデシル硫酸ナトリウム[SDS])、およびDNAの酵素的破壊(DNase処理)の3つのステップが含まれます。我々の知る限り、これはマウス胎児骨格筋を脱細胞化するための最初の確立されたプロトコルである。
この3DインビトロシステムをLAMA2-CMDの研究に使用するには、脱細胞化後のラミニンα2鎖を維持することが重要です。したがって、異なる洗剤(SDSおよびTriton X-100)および濃度(0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、および0.5%)がテストされた最適化プロトコルが実装された(データは示されていない)。ラミニンα2タンパク質の細胞除去および保存のための最適な選択は、0.05%SDSであることがわかった。十分に確立された筋芽細胞株であるC2C12細胞16,17を使用して、dECMを播種しました。これらの細胞はdECMに侵入し、増殖し、これらの足場内で分化し、新しいECMタンパク質を合成します。この3Din vitroモデルの作成の成功は、胎児の筋形成、LAMA2-CMDの発症に関与する分子および細胞プロセスを理解するための新しいアプローチを提供し、ECMと骨格筋細胞間のコミュニケーションが破壊される他の筋肉疾患に拡張することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ECMは、すべての組織に存在する高分子の複雑なネットワークであり、細胞の挙動と機能の調節に重要な役割を果たします2。ECMは、細胞が付着するための物理的な足場として機能し、増殖、運動性、分化、アポトーシスなどの細胞プロセスをアクティブに調節する手がかりを提供します。したがって、ECMの適切な形成と維持は、発生と恒常性の両方にとって不可欠です<sup clas…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、Association Française contre les Myopathies(AFM-Téléthon;契約番号23049)、MATRIHEALTHプロジェクト、およびcE3cユニット資金UIDB/00329/2020によって資金提供されました。MATRIHEALTHプロジェクトを支援することを選択したドナーのエンリケ・メイレレスに感謝します。この作業は、ポルトガルのバイオイメージングプラットフォーム(参照PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122)のノードである理学部顕微鏡施設のインフラストラクチャの恩恵を受けており、画像の取得と処理を支援してくれたルイスマルケスに感謝します。最後に、技術サポートを提供してくれたマルタパルマと寛大な貢献をしてくれた研究チームに感謝します。
Materials
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
Referências
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