Summary

توحيد مقايسة حبة القياس الخلوي على أساس الأجسام المضادة لصفار البيض

Published: May 19, 2023
doi:

Summary

يصف هذا البروتوكول منهجية لإعداد حبات اللاتكس للمقايسات باستخدام الأجسام المضادة IgY للكشف عن المستضد.

Abstract

المقايسات المناعية هي اختبارات مهمة للكشف عن العديد من الأهداف الجزيئية. من بين الطرق المتاحة حاليا ، اكتسب فحص حبة القياس الخلوي أهمية في العقود الأخيرة. يمثل كل كرة مجهرية يقرأها الجهاز حدثا تحليليا لقدرة التفاعل بين الجزيئات قيد الاختبار. تتم قراءة الآلاف من هذه الأحداث في اختبار واحد ، وبالتالي ضمان دقة عالية في الفحص وقابلية الاستنساخ. يمكن أيضا استخدام هذه المنهجية في التحقق من صحة المدخلات الجديدة ، مثل الأجسام المضادة IgY ، لتشخيص الأمراض. يتم الحصول على هذه الأجسام المضادة من خلال تحصين الدجاج بالمستضد محل الاهتمام ثم استخراج الغلوبولين المناعي من صفار بيض الحيوانات. لذلك ، هذه طريقة غير مؤلمة ومثمرة للغاية للحصول على الأجسام المضادة. بالإضافة إلى منهجية للتحقق عالي الدقة من قدرة التعرف على الأجسام المضادة لهذا الفحص ، تقدم هذه الورقة أيضا طريقة لاستخراج هذه الأجسام المضادة ، وتحديد أفضل ظروف اقتران للأجسام المضادة وخرز اللاتكس ، وتحديد حساسية الاختبار.

Introduction

من بين تقنيات المقايسة المناعية التي تهدف إلى تشخيص الأمراض ، ظهر فحص حبة القياس الخلوي كنهج حساس للغاية وموثوق ، لأنه يسمح بتحليل آلاف الجسيمات في اختبار واحد1. هذه التقنية ، بالإضافة إلى الإنتاجية العالية والسماح باستخدام كميات أصغر من العينات ، تقدم أيضا مرونة كبيرة ، لأنها تسمح باكتشاف العديد من الجزيئات ، مثل السيتوكينات وجزيئات الالتصاق والأنماط المتماثلة للأجسام المضادة والبروتينات 2,3.

يتم استخدام جزيئات مختلفة لتطوير هذه المقايسات ، من بينها حبات اللاتكس ، والتي تعد مدخلات فعالة ومنخفضة التكلفة. يمكن أن تقدم هذه التعديلات على سطحها ، مثل وجود مجموعات وظيفية أو بروتينات تسمح بالاقتران التساهمي أو غير التساهمي لجزيئات معينة3،4،5.

تستخدم هذه المقايسات المناعية مكونات مثل المستضدات والأجسام المضادة لإجراء الكشف عن علامات المرض وعادة ما تتطلب أجساما مضادة من الثدييات مثل الفئران والأرانب والماعز. هذا يخلق مشاكل تتعلق بالقضايا الأخلاقية ، لأن تحصين الثدييات يتطلب عموما العديد من الحيوانات للحصول على عائد جيد ، وكذلك الأداء المتكرر للإجراءات التي تؤدي إلى معاناة الحيوانات 6,7. بديل لذلك هو استخدام الأجسام المضادة IgY المعزولة من صفار البيض من الدجاج المحصن ، حيث يمكن العثور على تركيزات عالية من الأجسام المضادة المحددة ضد المستضدات الملقحة في صفار البيض. إنتاج الدجاج يعادل إنتاج 4.3 أرانب على مدار عام 6,7.

وبالتالي ، فإن الهدف من هذا البروتوكول هو توفير طريقة لتقييم الأجسام المضادة IgY التي تم الحصول عليها من صفار بيض الدجاج باستخدام قياس التدفق الخلوي مع حبات اللاتكس. لهذا ، نقترح طريقة توحيد للمقايسة المناعية للخرزة الخلوية في شكل شطيرة باستخدام حبات اللاتكس. كنموذج ، استخدمنا الأجسام المضادة IgY الموجهة إلى مستضد البروتين الثاني الغني بالمتصورة المنجلية (IgY-Pf HRP2). نصف طريقة لاستخراج الأجسام المضادة ، ونناقش الخطوات الحاسمة لتحديد تركيز اقتران هذه الأجسام بخرز اللاتكس ، ونقدم تقييما لحدود اكتشاف المستضد. الدقة العالية لقياس التدفق الخلوي ، إلى جانب التكلفة المنخفضة لخرز اللاتكس ، تجعل هذه التقنية قابلة للتطبيق لتحليل أدوات المقايسة المناعية ، مثل الأجسام المضادة والمستضدات. يمكن استخدام هذه الطريقة للكشف عن أهداف متنوعة.

Protocol

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول. 1. استخراج IgY من صفار البيض صحة البيضاغمر البيض (الذي تم وضعه حديثا أو حتى 4 أيام بعد وضعه ، من سلالة Gallus gallus Dekalb White) في محلول مخف…

Representative Results

يقدم الشكل 2 تمثيلا بيانيا لعملية استخراج الأجسام المضادة IgY عن طريق التحمض ، متبوعا بالفصل باستخدام حمض الكابريليك (الشكل 2). الشكل 2: تمثيل تخطيط?…

Discussion

طريقة ترسيب الجسم المضاد IgY عن طريق تقليل الأس الهيدروجيني متبوعا بفصل الدهون باستخدام حمض الكابريليك فعالة في عزل الأجسام المضادة الكلية دون أي خسارة في الوظائف. الطريقة المقترحة هنا أبسط وأرخص من تلك التي أبلغ عنها Redwan et al.11 ، والتي استخدمت أيضا الترسيب عن طريق التحمض وحمض ا…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن نشكر FIOCRUZ (“برنامج التفوق في مجال العلوم التطبيقية في جامعة أمازوناس الفيدرالية – UFAM) ، و Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) ، ومؤسسة أمبارو à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) ، ومؤسسة أمبارو à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) لتقديم المنح الدراسية. تم إنشاء الشكل 2 والشكل 4 باستخدام biorender.com.

Materials

Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey Sigma-Aldrich SAB4600031
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 Sigma-Aldrich SAB4600388
BD FACSCanto II BD Biosciences BF-FACSC2
BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) BD Biosciences 655050
BD FACSDiva software 7.0 BD Biosciences 655677
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad #5000006
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Caprilic acid Sigma-Aldrich O3907
Centrifuge 5702 R Eppendorf Z606936
Chloride 37% acid molecular grade NEON 02618 NEON
CML latex, 4% w/v Invitrogen C37253
Megafuge 8R Thermo Scientific TS-HM8R
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) Sigma-Aldrich E7750-1G
N-Hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 130672-25G
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich 1003335620
Sodium hydroxide Acs Cientifica P.10.0594.024.00.27
Sodium hypochlorite Acs Cientifica R09211000
Thermo Mixer Heat/Cool KASVI K80-120R

Referências

  1. Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).
  2. de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review. Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).
  3. Morgan, E., et al. Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).
  4. Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
  5. Kellar, K. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).
  6. Schade, R., et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).
  7. Xu, Y., et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review. Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).
  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  9. Sousa, L. P., et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).
  10. Klimentzou, P., et al. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).
  11. Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk. Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).
  12. Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents. Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).
  13. Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).
  14. Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).
  15. Ko, K. Y., Ahn, D. U. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).
  16. Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure. Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).
  17. Simonova, M. A., et al. xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).
  18. Sharma, P., et al. A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins. PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).
  19. Merbah, M., et al. Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes. Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).

Play Video

Citar este artigo
Corrêa Glória, J., Oliveira Chaves, Y., Marques de Figueiredo, A., Coutinho de Souza, C., Duarte da Silva, E. R., Lopes Batista, J. C., Nogueira, P. A., Morais Mariúba, L. A. Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies. J. Vis. Exp. (195), e65123, doi:10.3791/65123 (2023).

View Video