Yumurta sarısı antikorlarına dayalı sitometrik boncuk testinin standardizasyonu
Summary
Bu protokol, antijen tespiti için IgY antikorları kullanan tahliller için lateks boncukların hazırlanması için bir metodolojiyi açıklar.
Abstract
İmmünoanalizler, çok sayıda moleküler hedefin tespiti için önemli testlerdir. Şu anda mevcut olan yöntemler arasında, sitometrik boncuk testi son yıllarda önem kazanmıştır. Ekipman tarafından okunan her mikroküre, test edilen moleküller arasındaki etkileşim kapasitesinin bir analiz olayını temsil eder. Bu olayların binlercesi tek bir tahlilde okunur, böylece yüksek tahlil doğruluğu ve tekrarlanabilirlik sağlanır. Bu metodoloji, hastalıkların teşhisi için IgY antikorları gibi yeni girdilerin doğrulanmasında da kullanılabilir. Bu antikorlar, tavukların ilgilenilen antijen ile aşılanması ve daha sonra hayvanların yumurta sarısından immünoglobulinin çıkarılmasıyla elde edilir; Bu nedenle, bu, antikorları elde etmek için ağrısız ve oldukça verimli bir yöntemdir. Bu testin antikor tanıma kapasitesinin yüksek hassasiyetli doğrulanması için bir metodolojiye ek olarak, bu makale ayrıca bu antikorların ekstrakte edilmesi, antikorlar ve lateks boncuklar için en iyi bağlanma koşullarının belirlenmesi ve testin duyarlılığının belirlenmesi için bir yöntem sunmaktadır.
Introduction
Hastalıkların teşhisine yönelik immünoassay teknikleri arasında sitometrik boncuk testi, tek bir tahlilde binlerce partikülün analizine izin verdiği için oldukça hassas ve güvenilir bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır1. Bu teknik, yüksek üretkenliğe sahip olmasının ve daha küçük hacimli numunelerin kullanımına izin vermesinin yanı sıra, sitokinler, adezyon molekülleri, antikor izotipleri ve proteinler gibi çeşitli moleküllerin saptanmasına izin verdiği için büyük esneklik de sunar 2,3.
Bu tahlillerin geliştirilmesi için farklı partiküller kullanılır, bunların arasında etkili ve düşük maliyetli bir girdi olan lateks boncuklar da vardır. Bunlar, belirli moleküllerin 3,4,5 kovalent veya kovalent olmayan bağlanmasına izin veren fonksiyonel grupların veya proteinlerin varlığı gibi yüzeylerinde değişiklikler sunabilir.
Bu immünolojik testler, hastalık belirteçlerinin tespitini gerçekleştirmek için antijenler ve antikorlar gibi bileşenleri kullanır ve genellikle fareler, tavşanlar ve keçiler gibi memelilerden antikorlar gerektirir. Bu, etik konularla ilgili sorunlar yaratır, çünkü memelilerin aşılanması genellikle birçok hayvanın iyi bir verim elde etmesini ve hayvanların acı çekmesine yol açan prosedürlerin sık sık uygulanmasını gerektirir 6,7. Buna bir alternatif, aşılanmış tavukların yumurta sarısından izole edilen IgY antikorlarının kullanılmasıdır, çünkü aşılanmış antijenlere karşı spesifik antikorların yüksek konsantrasyonları yumurta sarısında bulunabilir; Bir tavuğun üretimi, bir yıl boyunca 4.3 tavşan üretimineeşdeğerdir 6,7.
Bu nedenle, bu protokolün amacı, lateks boncuklu akış sitometrisi kullanılarak tavuk yumurtası sarısından elde edilen IgY antikorlarının değerlendirilmesi için bir yöntem sağlamaktır. Bunun için, lateks boncuklar kullanılarak sandviç formatında bir sitometrik boncuk immünolojik testi için bir standardizasyon yöntemi öneriyoruz. Model olarak, Plasmodium falciparum histidin açısından zengin protein II antijenine (IgY-PfHRP2) yönlendirilmiş IgY antikorları kullanıldı. Antikorların ekstraksiyonu için bir yöntem açıklıyoruz, bunların lateks boncuklara bağlanma konsantrasyonunu tanımlamak için kritik adımları tartışıyoruz ve antijenin tespit sınırının bir değerlendirmesini sunuyoruz. Akış sitometrisinin yüksek doğruluğu, lateks boncukların düşük maliyeti ile birleştiğinde, bu tekniği antikorlar ve antijenler gibi immünoassay araçlarının analizi için uygulanabilir kılar. Bu yöntem, çeşitli hedeflerin tespiti için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
IgY antikorunun pH redüksiyonu ve ardından kaprilik asit kullanılarak lipid ayrımı ile çökeltilmesi yöntemi, işlevsellikte herhangi bir kayıp olmadan toplam antikorların izole edilmesinde etkilidir. Burada önerilen yöntem, asitleştirme ve kaprilik asit ile çökeltmeyi de kullanan, ancak daha karmaşık ve zahmetli bir protokole sahip olan Redwan ve ark.11 tarafından bildirilenden daha basit ve daha ucuzdur. Bu yöntem aynı zamanda, diğerlerinin yanı sıra PEG çökeltme 12,13, s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
FIOCRUZ’a (“Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane – ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA”), Biyoteknoloji Yüksek Lisans Programı’na (Universidade Federal do Amazonas’ta PPGBIOTEC – UFAM), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) ve Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas’a (FAPEAM) burs sağladıkları için. Şekil 2 ve Şekil 4 biorender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey | Sigma-Aldrich | SAB4600031 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 | Sigma-Aldrich | SAB4600388 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | BF-FACSC2 | |
| BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) | BD Biosciences | 655050 | |
| BD FACSDiva software 7.0 | BD Biosciences | 655677 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Caprilic acid | Sigma-Aldrich | O3907 | |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | Z606936 | |
| Chloride 37% acid molecular grade | NEON | 02618 NEON | |
| CML latex, 4% w/v | Invitrogen | C37253 | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | TS-HM8R | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) | Sigma-Aldrich | E7750-1G | |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672-25G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | 1003335620 | |
| Sodium hydroxide | Acs Cientifica | P.10.0594.024.00.27 | |
| Sodium hypochlorite | Acs Cientifica | R09211000 | |
| Thermo Mixer Heat/Cool | KASVI | K80-120R |
Referências
- Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).
- de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review. Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).
- Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
- Kellar, K. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).
- Schade, R., et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).
- Xu, Y., et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review. Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Sousa, L. P., et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).
- Klimentzou, P., et al. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).
- Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk. Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).
- Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents. Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).
- Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).
- Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).
- Ko, K. Y., Ahn, D. U. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).
- Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure. Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).
- Simonova, M. A., et al. xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).
- Sharma, P., et al. A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins. PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).
- Merbah, M., et al. Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes. Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).
