التصوير الحي لاستقبال أنبوب حبوب اللقاح العربي والإخصاب المزدوج باستخدام طريقة الحاجز شبه المختبري
Summary
هنا ، نصف تحسنا في طريقة شبه المختبر (SIV) لمراقبة توجيه أنبوب حبوب اللقاح واستقباله في Arabidopsis thaliana ، مما يزيد من تقبل البويضات. قد تقترن طريقة SIV مع الحاجز عالي الإنتاجية بخطوط علامات النبات المشيجي وأجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا لمراقبة عملية الإخصاب الديناميكية.
Abstract
في النباتات الزهرية، يعد نمو أنبوب حبوب اللقاح وتوجيهه (النبات المشيجي الذكري) داخل المدقة واستقبال أنبوب حبوب اللقاح بواسطة النبات المشيجي الأنثوي ضروريين للتخصيب المزدوج وتطور البذور لاحقا. تبلغ التفاعلات بين النباتات المشيجية الذكرية والأنثوية أثناء استقبال أنبوب حبوب اللقاح ذروتها في تمزق أنبوب حبوب اللقاح وإطلاق حيوانين منويين لإحداث الإخصاب المزدوج. نظرا لأن نمو أنبوب حبوب اللقاح والإخصاب المزدوج مخفيان بعمق داخل أنسجة الزهرة ، فمن الصعب ملاحظة هذه العملية في الجسم الحي.
تم تطوير وتنفيذ طريقة شبه مخبرية (SIV) لتصوير الخلايا الحية للتخصيب في النبات النموذجي Arabidopsis thaliana في العديد من التحقيقات. ساعدت هذه الدراسات في توضيح السمات الأساسية لكيفية حدوث عملية الإخصاب في النباتات المزهرة والتغيرات الخلوية والجزيئية التي تحدث أثناء تفاعل النباتات المشيجية الذكرية والأنثوية. ومع ذلك ، نظرا لأن تجارب تصوير الخلايا الحية هذه تتضمن استئصال البويضات الفردية ، فإنها تقتصر على عدد قليل من الملاحظات لكل جلسة تصوير ، مما يجعل هذا النهج مملا ويستغرق وقتا طويلا للغاية. من بين الصعوبات التقنية الأخرى ، غالبا ما يتم الإبلاغ عن فشل أنابيب حبوب اللقاح في تخصيب البويضات في المختبر ، مما يربك بشدة مثل هذه التحليلات.
هنا ، يتم توفير بروتوكول فيديو مفصل لتصوير استقبال أنبوب حبوب اللقاح والتخصيب بطريقة آلية وعالية الإنتاجية ، مما يسمح بما يصل إلى 40 ملاحظة لاستقبال أنبوب حبوب اللقاح وتمزيقه لكل جلسة تصوير. إلى جانب استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا وخطوط العلامات ، تتيح هذه الطريقة توليد أحجام عينات كبيرة مع تقليل استثمار الوقت. يتم تفصيل الفروق الدقيقة والنقاط الحرجة للتقنية ، بما في ذلك تدريج الزهور ، وتشريح ، وإعداد المتوسط ، والتصوير ، بوضوح في شكل فيديو لتسهيل البحث المستقبلي حول ديناميكيات توجيه أنبوب حبوب اللقاح والاستقبال والإخصاب المزدوج.
Introduction
يعتمد توليد نسل فريد وراثيا في الكائنات الحية التي تتكاثر جنسيا على الاندماج الناجح للجاميتات الذكرية والأنثوية. في النباتات الزهرية، يعتمد تفاعل جاميتين ذكريتين (منوية) مع جاميتين أنثويتين (البويضة والخلية المركزية) أثناء الإخصاب المزدوج على إطلاق الحيوانات المنوية من أنبوب حبوب اللقاح (النبات المشيجي الذكري). يتم التحكم في هذه العملية ، التي تسمى استقبال أنبوب حبوب اللقاح ، إلى حد كبير بواسطة الخلايا التآزرية الموجودة داخل كيس الجنين (النبات المشيجي الأنثوي)1,2. نظرا لأن استقبال أنبوب حبوب اللقاح يحدث في عمق الزهرة ، فقد تم إنشاء طريقة تسمح بتصوير الخلايا الحية للعملية ، تسمى استقبال أنبوب حبوب اللقاح شبه المختبري (SIV)، 3. باستخدام هذه الطريقة ، يتم وضع بويضات Arabidopsis المستأصلة على وسط إنبات حبوب اللقاح شبه السائلة ويتم استهدافها بواسطة أنابيب حبوب اللقاح التي تنمو من خلال وصمة العار وأسلوب المدقة المقطوعة عند تقاطع المسالك الناقلةللنمط 3،4. منذ تطوير هذه التقنية ، أدت الملاحظات التفصيلية إلى العديد من الاكتشافات المحيطة بتوجيه أنبوب حبوب اللقاح واستقباله وإخصابه. من بين أمور أخرى ، تشمل هذه الاكتشافات اكتساب أنبوب حبوب اللقاح الذي يستهدف الكفاءة من خلال النمو من خلال وصمة العار3 ، وبداية تذبذبات الكالسيوم داخل الخلايا في التآزر عند وصول أنبوب حبوب اللقاح5،6،7،8،9 ، وديناميكيات إطلاق خلايا الحيوانات المنوية والتخصيب عند انفجار أنبوب حبوب اللقاح10 . ومع ذلك ، نظرا لأن هذه التقنية تعتمد على استئصال البويضات ، فإن ملاحظات الإخصاب محدودة العدد ، وغالبا ما يكون استقبال أنبوب اللقاح شاذا ، مما يؤدي إلى فشل تمزق أنبوب حبوب اللقاح (الفيديو 1 والملف التكميلي 1). لذلك ، هناك حاجة إلى نهج أكثر كفاءة يسمح بإجراء تحليلات عالية الإنتاجية لاستقبال أنبوب حبوب اللقاح وتخصيبها.
عند تطوير هذا البروتوكول ، تم اختبار العديد من الأساليب الجديدة لتحليل استقبال أنبوب حبوب اللقاح ، والتي تمتد من أكثر الطرق “في المختبر” إلى أكثر الطرق “في الجسم الحي” ، وتم الاستقرار على تقنية فعالة تعتمد على استئصال الحاجز بأكمله ، مما يسمح بما يصل إلى 40 ملاحظة للتخصيب يوميا. هنا ، يتم تحديد الفروق الدقيقة والنقاط الحرجة لهذه التقنية ، بما في ذلك مراحل الزهور ، والتشريح ، والتحضير المتوسط ، وإعدادات التصوير. باتباع هذا البروتوكول ، يجب تسهيل الأبحاث التي تركز على توجيه أنبوب حبوب اللقاح واستقبال أنبوب حبوب اللقاح والإخصاب المزدوج. من المتوقع أن تعزز أحجام العينات الأعلى التي تسمح بها الطريقة السلامة العلمية للاستنتاجات المستخلصة من تجارب التصوير الحي. تشمل التطبيقات المحتملة لهذه التقنية ، على سبيل المثال لا الحصر ، إجراء ملاحظات للتغيرات الجزيئية والفسيولوجية في تركيزات الكالسيوم الخلوية ([Ca2+]cyt) ، أو درجة الحموضة ، أو H 2 O2أثناء تفاعلات المشيجات من خلال استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا. علاوة على ذلك ، يمكن ملاحظة التغيرات الخلوية ، مثل تنكس التآزر المستقبلي ، أو هجرة خلايا الحيوانات المنوية ، أو الزواج النووي ، بسهولة أكبر باستخدام هذه الطريقة المحسنة. أخيرا ، يمكن مراقبة توقيت المراحل المختلفة للإخصاب تحت المجهر واسع المجال ، ومن ثم يمكن إجراء تحليلات أكثر تفصيلا باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM) أو مجهر الإثارة ثنائي الفوتون (2PEM) للحصول على دقة أعلى وإعادة بناء ثلاثية الأبعاد.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا فعالا لتصوير استقبال أنبوب حبوب اللقاح والإخصاب المزدوج في أرابيدوبسيس. الطريقة المحسنة ، SIV cum septum ، تزيد بشكل كبير من النسبة المئوية والعدد الإجمالي لأحداث استقبال أنبوب اللقاح الناجحة التي يمكن ملاحظتها لكل جلسة تصوير. تظهر النتائج التمثيلية المو?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر سارة سيمونيني وستيفانو بينسيفينجا على التبرع ببناء pFG: roGFP2-ORP1-NLS وكريستوف إيشينبيرجر ويوهان ألميندينجر وفنسنت سوتر وسيليا بارو على نصائحهم بشأن الفحص المجهري. نرجو أن نعترف بنصيحة رافي بالانيفيلو وفيليب دينينجر وشارون كيسلر ومارك جونسون وتوموكازو كاواشيما وكل شخص آخر في المؤتمر الدولي للتكاثر الجنسي للنباتات 2022 الذين أبدوا اهتماما ببروتوكول بشأن SIV مع الحاجز. تم دعم هذا العمل من قبل جامعة زيورخ ومنح من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية إلى U.G.
Materials
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
Referências
- Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception. Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).
- Rotman, N., et al. Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro. BMC Plant Biology. 6, 7 (2006).
- Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).
- Iwano, M., et al. Cytoplasmic Ca2+ changes dynamically during the interaction of the pollen tube with synergid cells. Development. 139 (22), 4202-4209 (2012).
- Ngo, Q., Vogler, H., Lituiev, D., Nestorova, A., Grossniklaus, U. A calcium dialog mediated by the FERONIA signal transduction pathway controls plant sperm delivery. Developmental Cell. 29 (4), 491-500 (2014).
- Denninger, P., et al. Male-female communication triggers calcium signatures during fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4645 (2014).
- Hamamura, Y., et al. Live imaging of calcium spikes during double fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4722 (2014).
- Ponvert, N., Johnson, M. Synergid calcium ion oscillations define a new feature of pollen tube reception critical for blocking interspecific hybridization. bioRxiv. , (2020).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).
