セミインビトロ中隔法によるシロイヌナズナの花粉管受容と二重受精のライブイメージング
Summary
本稿では,シロイヌナズナの花粉管誘導・受容観察のためのセミインビトロ(SIV)法の改良により,胚珠の受容性を高める方法について述べる.ハイスループットSIV兼セプタム法は、配偶体マーカーラインおよび遺伝的にコード化されたバイオセンサーと組み合わせて、受精の動的プロセスを監視できます。
Abstract
顕花植物では、雌しべ内の花粉管(雄性配偶体)の成長と誘導、および雌性配偶体による花粉管の受容が二重受精とその後の種子発育に不可欠です。花粉管受容中の雄と雌の配偶体の相互作用は、花粉管破裂と2つの精子細胞の放出で最高潮に達し、二重受精をもたらします。花粉管の成長と二重受精は花の組織内に深く隠れているため、この過程を 生体内で観察することは困難です。
モデル植物シロイヌナズナの受精の生細胞イメージングのためのセミインビトロ(SIV)法が開発され、いくつかの研究で実施されています。これらの研究は、顕花植物で受精プロセスがどのように起こるか、そして雄と雌の配偶体の相互作用の間にどのような細胞的および分子的変化が起こるかという基本的な特徴を解明するのに役立ちました。ただし、これらの生細胞イメージング実験には個々の胚珠の切除が含まれるため、イメージングセッションあたりの観察数が少なく、このアプローチは面倒で非常に時間がかかります。他の技術的困難の中でも、花粉管がin vitroで胚珠を受精させることができないことがしばしば報告され、そのような分析はひどく混乱します。
ここでは、花粉管の受容と受精を自動化されたハイスループットな方法でイメージングするための詳細なビデオプロトコルが提供されており、イメージングセッションごとに花粉管の受容と破裂を最大40回観察できます。遺伝的にコードされたバイオセンサーとマーカーラインの使用と組み合わせることで、この方法は、時間の投資を抑えて大きなサンプルサイズを生成することを可能にします。花の病期分類、解剖、培地調製、イメージングなど、この技術のニュアンスと重要なポイントは、花粉管の誘導、受容、および二重受精のダイナミクスに関する将来の研究を容易にするために、ビデオ形式で明確に詳細に説明されています。
Introduction
有性生殖生物における遺伝的にユニークな子孫の生成は、男性と女性の配偶子の融合の成功に依存しています。顕花植物では、二重受精中の2つの雄性配偶子(精子細胞)と2つの雌配偶子(卵細胞および中心細胞)との相互作用は、花粉管(雄性配偶体)からの精子放出に依存する。このプロセスは花粉管受容と呼ばれ、胚嚢内に存在する相乗細胞(雌性配偶体)によって大きく制御されています1,2。花粉管受容は花の奥深くで行われるため、セミインビトロ(SIV)花粉管受容と呼ばれる生細胞イメージングを可能にする方法が確立されました3。この方法では、切除されたシロイヌナズナを半液体の花粉発芽培地に置き、スタイル伝達管接合部で切断された雌しべの柱頭とスタイルを通して成長する花粉管によって標的とされます3,4。この技術の開発以来、詳細な観察により、花粉管の誘導、受容、および受精を取り巻くいくつかの発見につながりました。とりわけ、これらの発見には、柱頭3を介した成長による花粉管標的能力の獲得、花粉管到達時の相乗作用における細胞内カルシウム振動の開始5,6,7,8,9、および花粉管破裂時の精子細胞の放出と受精のダイナミクスが含まれます10.しかし、この技術は胚珠の摘出に依存しているため、受精の観察数は限られており、花粉管の受容が異常であることが多く、花粉管破裂の失敗につながります(ビデオ1および補足ファイル1)。したがって、花粉管の受容と受精のハイスループット分析を可能にする、より効率的なアプローチが必要です。
このプロトコルの開発では、花粉管の受容を分析するためのいくつかの新しいアプローチがテストされ、最も「in vitro」の方法から最も「in vivo」の方法まで、中隔全体の切除に基づく効率的な技術が決定され、1日あたり最大40回の受精観察が可能になりました。ここでは、花の病期分類、解剖、培地の準備、イメージング設定など、技術のニュアンスと重要なポイントについて概説します。このプロトコルに従うことにより、花粉管誘導、花粉管受容、および二重受精に焦点を当てた研究が促進されるはずです。この方法が可能にするより高いサンプルサイズは、ライブイメージング実験から導き出された結論の科学的健全性を強化することが期待されます。この技術の潜在的な用途には、遺伝的にコードされたバイオセンサーの使用による配偶体相互作用中の細胞質カルシウム濃度([Ca2+]cyt)、pH、またはH2O2の分子的および生理学的変化の観察を行うことが含まれるが、これらに限定されない。さらに、受容的相乗作用の変性、精子細胞移動、または核分裂などの細胞学的変化は、この改良された方法を使用してより容易に観察することができる。最後に、受精のさまざまな段階のタイミングを広視野顕微鏡で監視し、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)または2光子励起顕微鏡(2PEM)を使用してより詳細な分析を行い、より高い解像度と3D再構成を行うことができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿は、 シロイヌナズナの花粉管受容と二重受精のイメージングのための効率的なプロトコルを紹介します。改良された方法であるSIV cum septumは、イメージングセッションごとに観察可能な花粉管受信イベントの成功率と総数を大幅に増加させます。ここに示す代表的な結果は、41個の花粉管受容イベントが成功し、10個の胚珠が受容障害(~80%効率)を示すイメージングセッシ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pFG:roGFP2-ORP1-NLSコンストラクトを寄贈してくださったSara Simonini氏とStefano Bencivenga氏、顕微鏡に関するアドバイスをくださったChristof Eichenberger氏、Johann Almendinger氏、Vincent Sutter氏、Celia Baroux氏に感謝します。ラヴィ・パラニヴェル、フィリップ・デニンガー、シャロン・ケスラー、マーク・ジョンソン、川島智和、および2022年の有性植物生殖に関する国際会議で、SIV兼セプタムに関するプロトコルに関心を示した他のすべての人からのアドバイスに感謝します。この研究は、チューリッヒ大学とスイス国立科学財団から英国への助成金によってサポートされました。
Materials
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
Referências
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