ניתוח טיפות שומנים מוכתמות פלואורסצנטיות עם שחזור תלת ממדי להערכת סטאטוזיס בכבד
Summary
במסמך זה, אנו מדגימים פרוטוקול מותאם BODIPY 493/503 מבוסס פלואורסצנטיות לאפיון טיפות שומנים ברקמת הכבד. באמצעות שימוש בהקרנות אורתוגונליות ושחזורים תלת-ממדיים, הפלואורופור מאפשר הבחנה מוצלחת בין סטאטוזיס מיקרו-שלפוחית וסטאטוזיס מקרו-שלפוחית ועשוי לייצג גישה משלימה לפרוטוקולים ההיסטולוגיים הקלאסיים להערכת סטאטוזיס בכבד.
Abstract
טיפות שומנים (LDs) הן אברונים מיוחדים המתווכים אחסון שומנים וממלאים תפקיד חשוב מאוד בדיכוי רעילות ליפוטוקסית ובמניעת תפקוד לקוי הנגרם על ידי חומצות שומן חופשיות (FAs). הכבד, בהתחשב בתפקידו הקריטי בחילוף החומרים של השומן בגוף, מאוים באופן מתמשך על ידי הצטברות תוך תאית של LDs בצורה של סטאטוזיס כבד microvesicular ו macrovesicular. האפיון ההיסטולוגי של LDs מבוסס בדרך כלל על צבעי דיאזו מסיסים בשומנים, כגון צביעת שמן אדום O (ORO), אך מספר חסרונות מעכבים באופן עקבי את השימוש בניתוח זה עם דגימות כבד. לאחרונה, פלואורופורים ליפופיליים 493/503 הפכו פופולריים להדמיה ואיתור LDs בשל קליטתם המהירה והצטברותם בליבת טיפת השומנים הניטרלית. למרות שרוב היישומים מתוארים היטב בתרביות תאים, יש פחות ראיות המוכיחות את השימוש האמין בבדיקות פלואורופור ליפופיליות ככלי הדמיה LD בדגימות רקמות. בזאת, אנו מציעים פרוטוקול אופטימלי מבוסס בורון דיפירומתין (BODIPY) 493/503 להערכת LDs בדגימות כבד ממודל בעלי חיים של סטאטוזיס כבד המושרה על ידי דיאטה עתירת שומן (HFD). פרוטוקול זה מכסה הכנת דגימות כבד, חתך רקמות, צביעת BODIPY 493/503, רכישת תמונה וניתוח נתונים. אנו מדגימים מספר מוגבר, עוצמה, יחס שטח וקוטר של LDs בכבד בעת הזנת HFD. באמצעות הקרנות אורתוגונליות ושחזורים תלת-ממדיים, ניתן היה לצפות בתוכן המלא של שומנים ניטרליים בליבת LD, שהופיעו כטיפות כמעט כדוריות. יתר על כן, עם פלואורופור BODIPY 493/503, הצלחנו להבחין בין microvesicles (1 מיקרומטר < d ≤ 3 מיקרומטר), שלפוחיות ביניים (3 מיקרומטר 9 מיקרומטר), המאפשר הבחנה מוצלחת של סטאטוזיס microvesicular ו macrovesicular. בסך הכל, פרוטוקול BODIPY 493/503 מבוסס פלואורסצנטיות זה הוא כלי אמין ופשוט לאפיון LD בכבד ועשוי לייצג גישה משלימה לפרוטוקולים ההיסטולוגיים הקלאסיים.
Introduction
טיפות ליפידים (LDs), הנתפסות באופן קלאסי כמחסני אנרגיה, הן אברונים תאיים מיוחדים המתווכים אחסון שומנים, והן מהוות ליבת שומנים הידרופובית ניטרלית, המכילה בעיקר אסטרי כולסטרול וטריגליצרידים (TGs), עטופים בשכבה אחת פוספוליפידית 1,2,3.
ביוגנזה של LD מתרחשת ברשתית האנדופלסמית (ER), החל בסינתזה של טריאצילגליצרול (TAG) ואסטרי סטרול. שומנים ניטרליים מפוזרים בין העלעלים של השכבה הדו-שכבתית של חדר המיון בריכוזים נמוכים, אך מתמזגים לעדשות שמן שגדלות ונובטות לטיפות כמעט כדוריות מממברנת המיון כאשר הריכוז התוך-תאי שלהם עולה4. לאחר מכן, חלבונים מדו-שכבתיים של ER וציטוזול, במיוחד ממשפחת החלבונים פריליפין (PLIN), עוברים טרנסלוקציה לפני השטח של LDs כדי להקל על ניצנים 5,6,7,8,9.
באמצעות סינתזת חומצות שומן חדשות ואיחוי LD או התמזגות, LDs גדלים לגדלים שונים. בהתאם לכך, הגודל והמספר של LDs שונים במידה ניכרת בין סוגי תאים שונים. טיפות קטנות (בקוטר 300-800 ננומטר), הידועות בשם LDs ראשוניים (iLDs), יכולות להיווצר כמעט על ידי כל התאים4. מאוחר יותר בהיווצרות LD, רוב התאים מסוגלים להמיר iLDs מסוימים ל- LDs גדולים יותר המרחיבים (eLDs בקוטר >1 מיקרומטר). עם זאת, רק סוגי תאים ספציפיים, כגון אדיפוציטים והפטוציטים, יש את היכולת ליצור LDs ענקיים או גדולים (עד עשרות מיקרון קוטר)4,10.
LDs ממלאים תפקיד חשוב מאוד בוויסות חילוף החומרים של שומנים בתאים, דיכוי ליפוטוקסיות ומניעת לחץ בחדר המיון, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, ובסופו של דבר, מוות תאי הנגרם על ידי חומצות שומן חופשיות (FAs)11,12,13,14. יתר על כן, LDs היו מעורבים גם בוויסות ביטוי גנים, שכפול נגיפים של חלבונים, וסחר בממברנות ואיתות15,16,17. לכן, הרגולציה השגויה של ביוגנזה LD היא סימן היכר של מחלות כרוניות הקשורות לתסמונת מטבולית, השמנת יתר, סוכרת מסוג 2 (T2DM) ו / או טרשת עורקים, אם להזכיר רק כמה 18,19,20.
הכבד, כמרכז מטבולי, אחראי בעיקר על חילוף החומרים של שומנים על ידי אחסון ועיבוד שומנים, ולכן, הוא מאוים כל הזמן על ידי lipotoxicity21. סטאטוזיס בכבד (HS) הוא מאפיין נפוץ של סדרה של מחלות כבד מתקדמות ומאופיין בהצטברות שומנים תוך-תאית מוגזמת בצורה של LDs ציטוסוליים, שבסופו של דבר עלולים להוביל לתפקוד מטבולי לקוי של הכבד, דלקת וצורות מתקדמות של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי22,23,24,25. HS מתרחש כאשר קצב החמצון והייצוא של חומצות שומן כטריגליצרידים בתוך ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה מאוד (VLDLs) נמוך מקצב ספיגת חומצות השומן בכבד מהפלזמה ומסינתזת חומצות השומן דה נובו 26. הצטברות הכבד של שומנים מתרחשת לעתים קרובות בשתי צורות – סטאטוזיס microvesicular ו macrovesicular – ואלה מציגים מאפיינים cytoarchitectonic מובהקים27. בדרך כלל, סטאטוזיס microvesicular מאופיין על ידי נוכחות של LDs קטנים מפוזרים ברחבי hepatocyte עם הגרעין ממוקם במרכז, ואילו סטאטוזיס macrovesicular מאופיין על ידי נוכחות של LD גדול אחד שתופס את החלק הגדול של hepatocyte, דוחף את הגרעין לפריפריה28,29. יש לציין כי שני סוגים אלה של סטאטוזיס נמצאים לעתים קרובות יחד, ועדיין לא ברור כיצד שני דפוסי LD אלה משפיעים על פתוגנזה של מחלות, שכן הראיות עדיין אינן עקביות 31,32,33,34. עם זאת, סוג כזה של ניתוח משמש לעתים קרובות כ”תקן ייחוס” במחקרים פרה-קליניים וקליניים כדי להבין את ההתנהגות הדינמית של LDs ולאפיין סטאטוזיס בכבד 29,34,35,36.
ביופסיות כבד, תקן הזהב לאבחון ודירוג HS, מוערכות באופן שגרתי על ידי ניתוח היסטולוגי של המטוקסילין ואאוזין (H&E), שבו טיפות שומנים מוערכות כוואקולים לא מוכתמים במקטעי כבד מוכתמים H&E37. בעוד מקובל עבור הערכת סטאטוזיס macrovesicular, סוג זה של מכתים בדרך כלל מצמצם את ההערכה של סטאטוזיס microvesicular38. צבעי דיאזו מסיסים בשומנים, כגון Oil Red O (ORO), משולבים באופן קלאסי עם מיקרוסקופ brightfield כדי לנתח מאגרי שומנים תוך תאיים, אך עדיין יש להם מספר חסרונות: (i) השימוש באתנול או איזופרופנול בתהליך הצביעה, אשר לעתים קרובות גורם לשיבוש של LDs המקוריים ואיחוי מדי פעם למרות שהתאים קבועים39; (ii) האופי הגוזל זמן, שכן פתרון ORO דורש המסה וסינון של אבקה טרייה בשל חיי המדף המוגבלים, ובכך תורם לתוצאות פחות עקביות; (iii) והעובדה כי ORO מכתים יותר מאשר רק טיפות שומנים ולעתים קרובות מעריך יתר על המידה סטאטוזיסבכבד 38.
כתוצאה מכך, פלואורופורים ליפופיליים חדירים לתאים, כגון אדום הנילוס, שימשו בדגימות חיות או קבועות כדי להתגבר על חלק מהמגבלות שהוזכרו לעיל. עם זאת, האופי הלא ספציפי של תיוג אברוני שומנים בתאים מצמצם שוב ושוב את הערכות LD40. יתר על כן, התכונות הספקטרליות של אדום הנילוס משתנות בהתאם לקוטביות הסביבה, מה שלעתים קרובות יכול להוביל לשינויים ספקטרליים41.
הגשושית הפלואורסצנטית הליפופילית 1,3,5,7,8-פנטמתיל-4-בורה-3a,4adiaza-s-indacene (אורך גל עירור: 480 ננומטר; פליטה מרבית: 515 ננומטר; BODIPY 493/503) מציג מאפיינים הידרופוביים המאפשרים ספיגה מהירה שלו על ידי LDs תוך תאי, מצטבר בליבת טיפת השומנים, ולאחר מכן, פולט פלואורסצנטיות ירוקה בהירה12. שלא כמו אדום הנילוס, BODIPY 493/503 אינו רגיש לקוטביות הסביבה והוכח כסלקטיבי יותר, מכיוון שהוא מציג בהירות גבוהה עבור הדמיית LD. על מנת להכתים LDs ניטרליים, ניתן להשתמש בצבע זה בתאים חיים או קבועים ולשלב בהצלחה עם שיטות צביעה ו / או תיוג אחרות42. יתרון נוסף של הצבע הוא שהוא דורש מאמץ מועט כדי להכניס לתמיסה והוא יציב, ובכך מבטל את הצורך להכין אותו טרי לכל ניסוי42. למרות שהגשושית BODIPY 493/503 שימשה בהצלחה כדי להמחיש את הלוקליזציה והדינמיקה של LDs בתרביות תאים, דיווחים מסוימים הדגימו גם את השימוש האמין בצבע זה ככלי הדמיה LD ברקמות, כולל שריר vastus lateralis43 האנושי, שריר סוליאוסחולדה 42 ומעי עכבר44.
בזאת, אנו מציעים פרוטוקול מותאם מבוסס BODIPY 493/503 כגישה אנליטית חלופית להערכת מספר, שטח וקוטר LD בדגימות כבד ממודל בעלי חיים של סטאטוזיס כבד. הליך זה מכסה הכנת דגימות כבד, חתך רקמות, תנאי צביעה, רכישת תמונה וניתוח נתונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול BODIPY 493/503 מבוסס פלואורסצנטיות להערכת LD נועד לפתח גישת הדמיה חדשה להערכת סטאטוזיס בכבד. בהתחשב בקורלציה החזקה בין השמנת יתר למחלת כבד שומני, הדיאטה עתירת השומן בסגנון מערבי שימשה לביסוס מודל חייתי של סטאטוזיס כבד26. עלייה חזקה בתכולת TG בכבד אושרה על ידי ערכת בדיקה כמותי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי קרנות לאומיות ואירופיות באמצעות קרן המדע והטכנולוגיה הפורטוגזית (FCT), הקרן האירופית לפיתוח אזורי (FEDER) ו- Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) ו- POCI-01-0145-FEDER-007440. המחברים רוצים להודות על התמיכה של iLAB – Microscopy and Bioimaging Lab, מתקן של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת קוימברה וחבר בתשתית הלאומית PPBI-Portuguese Platform of BioImaging (POCI-01-0145-FEDER-022122), כמו גם תמיכה של FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.
Materials
| 1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set | Fisher Scientific | ||
| 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D3922 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR | D1306 | |
| 70% ethanol | Honeywell | 10191455 | |
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
| Automatic analyzer Hitachi 717 | Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany | 8177-30-0010 | |
| Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) | Daido Sangyo Co., Ltd, Japon | _ | |
| Blade | Leica | 221052145 | Used in the cryostat |
| Cell Profiler version 4.2.5 | https://cellprofiler.org/releases/ | Used to analyse the acquired images | |
| Coverslips | Menzel-Glaser, Germany | _ | |
| Cryomolds | Tissue-Tek | _ | |
| Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S | Leica Biosystems | _ | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D-8418 | Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Dry ice container (styrofoam cooler) | Novolab | A26742 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools, Germany | 11295-10 | |
| Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) |
Thermo Scientific | 150318 | Used to weigh the liver after dissection |
| Glycergel | DAKO Omnis | S303023 | |
| GraphPad Prism software, version 9.3.1 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA | ||
| High-fat diet | Envigo, Barcelona, Spain | MD.08811 | |
| Ketamine (Nimatek 100 mg/mL) | Dechra | 791/01/14DFVPT | Used at a final concentration of 75 mg/kg |
| Laser scanning confocal microscope (QUASAR detection unit; ) | Carl Zeiss, germany | LSM 710 Axio Observer Z1 microscope | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Dechra | 1838 ESP / 020/01/07RFVPT | Used at a final concentration of 1 mg/kg |
| Needle | BD microlance | 300635 | |
| No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade |
Swann-Morton | 205 | |
| Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil) | Carl Zeiss, Germany | ||
| Paint brushes | Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections | |
| Peristaltic pump (Minipuls 3) | Gilson | 1004170 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | P3813 | |
| Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 | Swann-Morton | 0208 | |
| Slide staining system StainTray | Simport Scientific | M920 | |
| Standard diet | Mucedola | 4RF21 | |
| Superfrost Plus microscope slides | Menzel-Glaser, Germany | J1800AMNZ | |
| Tissue-Tek OCT mounting media | VWR CHEMICALS | 361603E | |
| Triglycerides colorimetric assay kit | Cayman Chemical | 10010303 | |
| Ultrasonic bath | Bandelin Sonorex | TK 52 | |
| Vannas spring scissors – 3 mm cutting edge |
Fine Science Tools, Germany | 15000-00 | |
| ZEN Black software | Zeiss |
Referências
- Klemm, R. W., Ikonen, E. The cell biology of lipid droplets: More than just a phase. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 1-3 (2020).
- Martin, S., Parton, R. G. Lipid droplets: A unified view of a dynamic organelle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 373-378 (2006).
- Thiele, C., Penno, A., Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. Lipid droplets. Encyclopedia of Cell Biology. , 273-278 (2016).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: From basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Bickel, P. E., Tansey, J. T., Welte, M. A. PAT proteins, an ancient family of lipid droplet proteins that regulate cellular lipid stores. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 419-440 (2009).
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Wang, L., Liu, J., Miao, Z., Pan, Q., Cao, W. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Jackson, C. L. Lipid droplet biogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 59, 88-96 (2019).
- Onal, G., Kutlu, O., Gozuacik, D., Dokmeci Emre, S. Lipid droplets in health and disease. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 128 (2017).
- Wang, H., Quiroga, A. D., Lehner, R., Yang, H., Li, P. Lipid Droplets. Methods in Cell Biology. , 107-127 (2013).
- Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , (2007).
- Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1260-1272 (2017).
- Roberts, M. A., Olzmann, J. A. Protein quality control and lipid droplet metabolism). Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 115-139 (2020).
- Filali-Mouncef, Y., et al. The ménage à trois of autophagy, lipid droplets and liver disease. Autophagy. 18 (1), 50-72 (2022).
- Bandyopadhyay, D., et al. Lipid droplets promote phase separation of Ago2 to accelerate Dicer1 loss and decelerate miRNA activity in lipid exposed hepatic cells. bioRxiv. , (2020).
- Farías, M. A., Diethelm-Varela, B., Navarro, A. J., Kalergis, A. M., González, P. A. Interplay between lipid metabolism, lipid droplets, and DNA virus infections. Cells. 11 (14), 2224 (2022).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: Lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
- Xu, S., Zhang, X., Liu, P. Lipid droplet proteins and metabolic diseases. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (5), 1968-1983 (2018).
- Herms, A., et al. Cell-to-cell heterogeneity in lipid droplets suggests a mechanism to reduce lipotoxicity. Current Biology. 23 (15), 1489-1496 (2013).
- Hooper, A. J., Adams, L. A., Burnett, J. R. Genetic determinants of hepatic steatosis in man. Journal of Lipid Research. 52 (4), 593-617 (2011).
- Parafati, M., Kirby, R. J., Khorasanizadeh, S., Rastinejad, F., Malany, S. A nonalcoholic fatty liver disease model in human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes, created by endoplasmic reticulum stress-induced steatosis. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2018).
- Nassir, F., Rector, R. S., Hammoud, G. M., Ibdah, J. A. Pathogenesis and prevention of hepatic steatosis. Gastroenterology & Hepatology. 11 (3), 167-175 (2015).
- Starekova, J., Reeder, S. B. Liver fat quantification: Where do we stand. Abdominal Radiology. 45 (11), 3386-3399 (2020).
- Fabbrini, E., Sullivan, S., Klein, S. Obesity and nonalcoholic fatty liver disease: Biochemical, metabolic, and clinical implications. Hepatology. 51 (2), 679-689 (2010).
- Kristiansen, M. N. B., Veidal, S. S., Christoffersen, C., Jelsing, J., Rigbolt, K. T. G. Molecular characterization of microvesicular and macrovesicular steatosis shows widespread differences in metabolic pathways. Lipids. 54 (1), 109-115 (2019).
- Tsutsumi, V., Nakamura, T., Ueno, T., Torimura, T., Aguirre-García, J., Muriel, P. Chapter 2: Structure and ultrastructure of the normal and diseased liver. Liver Pathophysiology. , 23-44 (2017).
- Tandra, S., et al. Presence and significance of microvesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 55 (3), 654-659 (2011).
- Nascimbeni, F., et al. Clinical relevance of liver histopathology and different histological classifications of NASH in adults. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 351-367 (2018).
- Yerian, L. Histopathological evaluation of fatty and alcoholic liver diseases. Journal of Digestive Diseases. 12 (1), 17-24 (2011).
- Stöppeler, S., et al. Gender and strain-specific differences in the development of steatosis in rats. Laboratory Animals. 47 (1), 43-52 (2013).
- Hübscher, S. G., Saxena, R. Alcohol-induced liver disease. Practical Hepatic Pathology: A Diagnostic Approach (Second Edition). , 371-390 (2018).
- Sethunath, D., et al. Automated assessment of steatosis in murine fatty liver. PLoS One. 13 (5), e0197242 (2018).
- Sinton, M. C., et al. Macrovesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease is a consequence of purine nucleotide cycle driven fumarate accumulation. bioRxiv. , (2020).
- de Conti, A., et al. Characterization of the variability in the extent of nonalcoholic fatty liver induced by a high-fat diet in the genetically diverse collaborative cross mouse model. The FASEB Journal. 34 (6), 7773-7785 (2020).
- Virarkar, M., Szklaruk, J., Jensen, C. T., Taggart, M. W., Bhosale, P. What’s new in hepatic steatosis. Seminars in Ultrasound, CT and MRI. 42 (4), 405-415 (2021).
- Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), e51092 (2012).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 42 (2015).
- Daemen, S., van Zandvoort, M. A. M. J., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2015).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), e77774 (2013).
- Nakano, T., et al. Ezetimibe impairs transcellular lipid trafficking and induces large lipid droplet formation in intestinal absorptive epithelial cells. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1865 (12), 158808 (2020).
- Adomshick, V., Pu, Y., Veiga-Lopez, A. Automated lipid droplet quantification system for phenotypic analysis of adipocytes using CellProfiler. Toxicology Mechanisms and Methods. 30 (5), 378-387 (2020).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Martinez-Lopez, N., Singh, R. Autophagy and lipid droplets in the liver. Annual Review of Nutrition. 35, 215-237 (2015).
- Collot, M., et al. Ultrabright and fluorogenic probes for multicolor imaging and tracking of lipid droplets in cells and tissues. Journal of the American Chemical Society. 140 (16), 5401-5411 (2018).
- Selvais, C. M., De Cock, L. L., Brichard, S. M., Davis-Lopez de Carrizosa, M. A. Fiber type and subcellular-specific analysis of lipid droplet content in skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: Jove. (184), e63718 (2022).
- Zhuang, H., et al. Long-term high-fat diet consumption by mice throughout adulthood induces neurobehavioral alterations and hippocampal neuronal remodeling accompanied by augmented microglial lipid accumulation. Brain, Behavior, and Immunity. 100, 155-171 (2022).
- Chen, J., Yue, F., Kuang, S. Labeling and analyzing lipid droplets in mouse muscle stem cells. STAR Protocols. 3 (4), 101849 (2022).
