Hepatik Steatoz Değerlendirmesi için Floresan Boyalı Lipit Damlacıklarının 3D Rekonstrüksiyon ile Analizi
Summary
Burada, karaciğer dokusunda lipid damlacık karakterizasyonu için optimize edilmiş bir BODIPY 493/503 floresan tabanlı protokol gösterilmektedir. Ortogonal projeksiyonların ve 3D rekonstrüksiyonların kullanılmasıyla, florofor mikro-veziküler ve makroveziküler steatoz arasında başarılı bir ayrım yapılmasına izin verir ve hepatik steatoz değerlendirmesi için klasik histolojik protokollere tamamlayıcı bir yaklaşımı temsil edebilir.
Abstract
Lipid damlacıkları (LD’ler), lipid depolanmasına aracılık eden ve lipotoksisiteyi baskılamada ve serbest yağ asitlerinin (FA’lar) neden olduğu işlev bozukluğunu önlemede çok önemli bir rol oynayan özel organellerdir. Karaciğer, vücudun yağ metabolizmasındaki kritik rolü göz önüne alındığında, LD’lerin hem mikro-veziküler hem de makroveziküler hepatik steatoz şeklinde hücre içi birikimi ile sürekli tehdit altındadır. LD’lerin histolojik karakterizasyonu tipik olarak Yağ Kırmızısı O (ORO) boyaması gibi lipitte çözünür diazo boyalarına dayanır, ancak bir dizi dezavantaj bu analizin karaciğer örnekleriyle kullanımını sürekli olarak engellemektedir. Daha yakın zamanlarda, lipofilik floroforlar 493/503, nötr lipit damlacık çekirdeğine hızlı alımları ve birikimleri nedeniyle LD’leri görselleştirmek ve bulmak için popüler hale gelmiştir. Çoğu uygulama hücre kültürlerinde iyi tanımlanmış olsa da, doku örneklerinde LD görüntüleme aracı olarak lipofilik florofor problarının güvenilir kullanımını gösteren daha az kanıt vardır. Burada, yüksek yağlı diyet (HFD) kaynaklı hepatik steatozun bir hayvan modelinden karaciğer örneklerinde LD’lerin değerlendirilmesi için optimize edilmiş bir bor dipirometen (BODIPY) 493/503 tabanlı protokol öneriyoruz. Bu protokol karaciğer örneği hazırlama, doku kesitleme, BODIPY 493/503 boyama, görüntü elde etme ve veri analizini kapsamaktadır. HFD beslenmesinde hepatik LD’lerin sayısının, yoğunluğunun, alan oranının ve çapının arttığını gösteriyoruz. Ortogonal projeksiyonlar ve 3D rekonstrüksiyonlar kullanarak, neredeyse küresel damlacıklar olarak görünen LD çekirdeğindeki nötr lipitlerin tam içeriğini gözlemlemek mümkündü. Dahası, florofor BODIPY 493/503 ile, mikro-parçacıkları (1 μm < d ≤ 3 μm), ara vezikülleri (3 μm 9 μm) ayırt edebildik ve mikro-veziküler ve makroveziküler steatozun başarılı bir şekilde ayırt edilmesini sağladık. Genel olarak, bu BODIPY 493/503 floresan tabanlı protokol, hepatik LD karakterizasyonu için güvenilir ve basit bir araçtır ve klasik histolojik protokollere tamamlayıcı bir yaklaşımı temsil edebilir.
Introduction
Klasik olarak enerji depoları olarak görülen lipit damlacıkları (LD’ler), lipit depolanmasına aracılık eden özel hücresel organellerdir ve esas olarak bir fosfolipid monokatmanı 1,2,3 tarafından kapsüllenen kolesterol esterleri ve trigliseritler (TG’ler) içeren hidrofobik nötr bir lipit çekirdeği içerirler.
LD biyogenezi, triasilgliserol (TAG) ve sterol esterlerinin sentezi ile başlayan endoplazmik retikulumda (ER) meydana gelir. Nötr lipitler, düşük konsantrasyonlarda ER çift katmanlı broşürler arasında dağılır, ancak hücre içi konsantrasyonları4 arttığında ER membranından neredeyse küresel damlacıklar halinde büyüyen ve tomurcuklanan yağ lenslerine birleşir. Daha sonra, ER çift katmanlı ve sitosolden proteinler, özellikle perilipin (PLIN) protein ailesi, tomurcuklanmayı kolaylaştırmak için LD’lerin yüzeylerine translokasyon yapar 5,6,7,8,9.
Yeni yağ asidi sentezi ve LD füzyonu veya birleşmesi yoluyla, LD’ler farklı boyutlarda büyür. Buna göre, LD’lerin boyutu ve sayısı farklı hücre tipleri arasında önemli ölçüde farklılık gösterir. İlk LD’ler (iLD’ler) olarak bilinen küçük damlacıklar (300-800 nm çapında), neredeyse tüm hücreler tarafından oluşturulabilir4. LD oluşumunda daha sonra, çoğu hücre bazı iLD’leri daha büyük olanları genişleten LD’lere (eLD’ler >1 μm çapında) dönüştürebilir. Bununla birlikte, adipositler ve hepatositler gibi sadece spesifik hücre tipleri, dev veya süper boyutlu LD’ler (onlarca mikron çapına kadar) oluşturma kapasitesine sahiptir4,10.
LD’ler, hücresel lipit metabolizmasının düzenlenmesinde, lipotoksisitenin baskılanmasında ve ER stresinin, mitokondriyal disfonksiyonun ve nihayetinde serbest yağ asitlerinin (FA’lar) neden olduğu hücre ölümünün önlenmesinde çok önemli bir rol oynamaktadır11,12,13,14. Ayrıca, LD’ler ayrıca gen ekspresyonunun, viral replikasyon proteini tutulmasının ve membran kaçakçılığının ve sinyalizasyonunun düzenlenmesinde de rol oynamıştır15,16,17. Bu nedenle, LD biyogenezinin yanlış düzenlenmesi, metabolik sendrom, obezite, tip 2 diabetes mellitus (T2DM) ve / veya arteriyoskleroz ile ilişkili kronik hastalıkların bir işaretidir.
Karaciğer, metabolik bir merkez olarak, lipitleri depolayarak ve işleyerek lipit metabolizmasından çoğunlukla sorumludur ve bu nedenle, lipotoksisite21 tarafından sürekli tehdit edilmektedir. Hepatik steatoz (HS), bir dizi ilerleyici karaciğer hastalığının ortak bir özelliğidir ve sonuçta karaciğer metabolik disfonksiyonuna, inflamasyona ve alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının ileri formlarına yol açabilen sitozolik LD’ler şeklinde aşırı hücre içi lipid birikimi ile karakterizedir22,23,24,25. HS, çok düşük yoğunluklu lipoproteinler (VLDL’ler) içindeki yağ asidi oksidasyonu ve trigliseritler olarak ihracat hızı, plazmadan hepatik yağ asidi alım hızından ve de novo yağ asidi sentezinden26 daha düşük olduğunda ortaya çıkar. Lipidlerin hepatik birikimi sıklıkla iki formda ortaya çıkar – mikro-veziküler ve makroveziküler steatoz- ve bunlar farklı sitoarkitektonik özellikler gösterir27. Tipik olarak, mikro-veziküler steatoz, çekirdeğin merkezi olarak yerleştirildiği hepatosit boyunca dağılmış küçük LD’lerin varlığı ile karakterize edilirken, makroveziküler steatoz, hepatositin büyük bölümünü kaplayan ve çekirdeği çevreye iten tek bir büyük LD’nin varlığı ile karakterize edilir28,29. Özellikle, bu iki tip steatoz sıklıkla birlikte bulunur ve bu iki LD paterninin hastalık patogenezini nasıl etkilediği belirsizliğini korumaktadır, çünkü kanıtlar hala tutarsızdır31,32,33,34. Bununla birlikte, bu tür analizler genellikle LD’lerin dinamik davranışını anlamak ve hepatik steatozukarakterize etmek için klinik öncesi ve klinik çalışmalarda bir “referans standardı” olarak kullanılır 29,34,35,36.
HS tanısı ve derecelendirilmesinde altın standart olan karaciğer biyopsileri, H&E boyalı karaciğer bölümlerinde lipid damlacıklarının lekelenmemiş vakuoller olarak değerlendirildiği histolojik hematoksilin ve eozin (H&E) analizi ile rutin olarak değerlendirilmektedir37. Makroveziküler steatoz değerlendirmesi için kabul edilebilir olsa da, bu tip boyama genellikle mikro-veziküler steatoz38’in değerlendirmesini daraltır. Yağ Kırmızısı O (ORO) gibi lipitte çözünür diazo boyaları, hücre içi lipit depolarını analiz etmek için klasik olarak parlak alan mikroskobu ile birleştirilir, ancak bunların hala bir takım dezavantajları vardır: (i) boyama işleminde etanol veya izopropanol kullanımı, bu da genellikle doğal LD’lerin bozulmasına ve hücrelerin sabitlenmesine rağmen ara sıra füzyona neden olur39; (ii) ORO çözeltisi, sınırlı raf ömrü nedeniyle taze tozun çözülmesini ve filtrelenmesini gerektirdiğinden, zaman alıcı doğa, böylece daha az tutarlı sonuçlara katkıda bulunur; (iii) ve ORO’nun sadece lipit damlacıklarından daha fazlasını boyadığı ve sıklıkla hepatik steatoz38’i abarttığı gerçeği.
Sonuç olarak, Nil Kırmızısı gibi hücre geçirgen lipofilik floroforlar, yukarıda belirtilen sınırlamaların bazılarının üstesinden gelmek için canlı veya sabit numunelerde kullanılmıştır. Bununla birlikte, hücresel lipid organel etiketlemesinin spesifik olmayan doğası, LD değerlendirmelerini tekrar tekrar daraltır40. Dahası, Nil Kırmızısı’nın spektral özellikleri, çevrenin polaritesine göre değişir ve bu da genellikle spektral kaymalara yol açabilir41.
Lipofilik floresan prob 1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (uyarma dalga boyu: 480 nm; emisyon maksimum: 515 nm; BODIPY 493/503), hücre içi LD’ler tarafından hızlı bir şekilde alınmasına izin veren, lipit damlacık çekirdeğinde biriken ve daha sonra parlak yeşil floresan12 yayan hidrofobiklik özellikleri sergiler. Nil Kırmızısı’nın aksine, BODIPY 493/503 çevre polaritesine duyarsızdır ve LD görüntüleme için yüksek parlaklık gösterdiği için daha seçici olduğu gösterilmiştir. Nötr LD’leri boyamak için, bu boya canlı veya sabit hücrelerde kullanılabilir ve diğer boyama ve / veya etiketleme yöntemleriyle başarıyla birleştirilebilir42. Boyanın bir diğer avantajı, bir çözeltiye yerleştirmek için çok az çaba gerektirmesi ve kararlı olmasıdır, böylece her deney için taze olarak hazırlama ihtiyacını ortadan kaldırır42. BODIPY 493/503 probu, hücre kültürlerinde LD’lerin lokalizasyonunu ve dinamiklerini görselleştirmek için başarıyla kullanılmış olsa da, bazı raporlar bu boyanın insan vastus lateralis kası43, sıçan soleus kası 42 ve fare bağırsağı44 dahil olmak üzere dokularda LD görüntüleme aracı olarak güvenilir bir şekilde kullanıldığını göstermiştir.
Burada, hepatik steatozun bir hayvan modelinden karaciğer örneklerinde LD sayısının, alanının ve çapının değerlendirilmesi için alternatif bir analitik yaklaşım olarak optimize edilmiş bir BODIPY 493/503 tabanlı protokol öneriyoruz. Bu prosedür karaciğer örneği hazırlama, doku kesitleme, boyama koşulları, görüntü elde etme ve veri analizini kapsar.
Protocol
Representative Results
Discussion
LD değerlendirmesi için bu BODIPY 493/503 floresan tabanlı protokol, hepatik steatozun değerlendirilmesi için yeni bir görüntüleme yaklaşımı geliştirmeyi amaçlamıştır. Obezite ve yağlı karaciğer hastalığı arasındaki güçlü korelasyon göz önüne alındığında, Batı tarzı yüksek yağlı diyet, hepatik steatoz26’nın bir hayvan modelini oluşturmak için kullanılmıştır. Hepatik TG içeriğinde sağlam bir artış, HFD ile beslenen hayvanlarda artmış bir hepatik l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Portekiz Bilim ve Teknoloji Vakfı (FCT), Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (FEDER) ve Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) ve POCI-01-0145-FEDER-007440 aracılığıyla Ulusal ve Avrupa Fonları tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar, Coimbra Üniversitesi Tıp Fakültesi’nin bir tesisi ve ulusal altyapı PPBI-Portekiz BiyoGörüntüleme Platformu’nun (POCI-01-0145-FEDER-022122) bir üyesi olan iLAB – Mikroskopi ve Biyogörüntüleme Laboratuvarı’nın desteğine ve FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142’nin desteğine teşekkür eder.
Materials
| 1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set | Fisher Scientific | ||
| 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D3922 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR | D1306 | |
| 70% ethanol | Honeywell | 10191455 | |
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
| Automatic analyzer Hitachi 717 | Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany | 8177-30-0010 | |
| Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) | Daido Sangyo Co., Ltd, Japon | _ | |
| Blade | Leica | 221052145 | Used in the cryostat |
| Cell Profiler version 4.2.5 | https://cellprofiler.org/releases/ | Used to analyse the acquired images | |
| Coverslips | Menzel-Glaser, Germany | _ | |
| Cryomolds | Tissue-Tek | _ | |
| Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S | Leica Biosystems | _ | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D-8418 | Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Dry ice container (styrofoam cooler) | Novolab | A26742 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools, Germany | 11295-10 | |
| Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) |
Thermo Scientific | 150318 | Used to weigh the liver after dissection |
| Glycergel | DAKO Omnis | S303023 | |
| GraphPad Prism software, version 9.3.1 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA | ||
| High-fat diet | Envigo, Barcelona, Spain | MD.08811 | |
| Ketamine (Nimatek 100 mg/mL) | Dechra | 791/01/14DFVPT | Used at a final concentration of 75 mg/kg |
| Laser scanning confocal microscope (QUASAR detection unit; ) | Carl Zeiss, germany | LSM 710 Axio Observer Z1 microscope | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Dechra | 1838 ESP / 020/01/07RFVPT | Used at a final concentration of 1 mg/kg |
| Needle | BD microlance | 300635 | |
| No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade |
Swann-Morton | 205 | |
| Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil) | Carl Zeiss, Germany | ||
| Paint brushes | Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections | |
| Peristaltic pump (Minipuls 3) | Gilson | 1004170 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | P3813 | |
| Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 | Swann-Morton | 0208 | |
| Slide staining system StainTray | Simport Scientific | M920 | |
| Standard diet | Mucedola | 4RF21 | |
| Superfrost Plus microscope slides | Menzel-Glaser, Germany | J1800AMNZ | |
| Tissue-Tek OCT mounting media | VWR CHEMICALS | 361603E | |
| Triglycerides colorimetric assay kit | Cayman Chemical | 10010303 | |
| Ultrasonic bath | Bandelin Sonorex | TK 52 | |
| Vannas spring scissors – 3 mm cutting edge |
Fine Science Tools, Germany | 15000-00 | |
| ZEN Black software | Zeiss |
Referências
- Klemm, R. W., Ikonen, E. The cell biology of lipid droplets: More than just a phase. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 1-3 (2020).
- Martin, S., Parton, R. G. Lipid droplets: A unified view of a dynamic organelle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 373-378 (2006).
- Thiele, C., Penno, A., Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. Lipid droplets. Encyclopedia of Cell Biology. , 273-278 (2016).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: From basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Bickel, P. E., Tansey, J. T., Welte, M. A. PAT proteins, an ancient family of lipid droplet proteins that regulate cellular lipid stores. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 419-440 (2009).
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Wang, L., Liu, J., Miao, Z., Pan, Q., Cao, W. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Jackson, C. L. Lipid droplet biogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 59, 88-96 (2019).
- Onal, G., Kutlu, O., Gozuacik, D., Dokmeci Emre, S. Lipid droplets in health and disease. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 128 (2017).
- Wang, H., Quiroga, A. D., Lehner, R., Yang, H., Li, P. Lipid Droplets. Methods in Cell Biology. , 107-127 (2013).
- Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , (2007).
- Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1260-1272 (2017).
- Roberts, M. A., Olzmann, J. A. Protein quality control and lipid droplet metabolism). Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 115-139 (2020).
- Filali-Mouncef, Y., et al. The ménage à trois of autophagy, lipid droplets and liver disease. Autophagy. 18 (1), 50-72 (2022).
- Bandyopadhyay, D., et al. Lipid droplets promote phase separation of Ago2 to accelerate Dicer1 loss and decelerate miRNA activity in lipid exposed hepatic cells. bioRxiv. , (2020).
- Farías, M. A., Diethelm-Varela, B., Navarro, A. J., Kalergis, A. M., González, P. A. Interplay between lipid metabolism, lipid droplets, and DNA virus infections. Cells. 11 (14), 2224 (2022).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: Lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
- Xu, S., Zhang, X., Liu, P. Lipid droplet proteins and metabolic diseases. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (5), 1968-1983 (2018).
- Herms, A., et al. Cell-to-cell heterogeneity in lipid droplets suggests a mechanism to reduce lipotoxicity. Current Biology. 23 (15), 1489-1496 (2013).
- Hooper, A. J., Adams, L. A., Burnett, J. R. Genetic determinants of hepatic steatosis in man. Journal of Lipid Research. 52 (4), 593-617 (2011).
- Parafati, M., Kirby, R. J., Khorasanizadeh, S., Rastinejad, F., Malany, S. A nonalcoholic fatty liver disease model in human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes, created by endoplasmic reticulum stress-induced steatosis. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2018).
- Nassir, F., Rector, R. S., Hammoud, G. M., Ibdah, J. A. Pathogenesis and prevention of hepatic steatosis. Gastroenterology & Hepatology. 11 (3), 167-175 (2015).
- Starekova, J., Reeder, S. B. Liver fat quantification: Where do we stand. Abdominal Radiology. 45 (11), 3386-3399 (2020).
- Fabbrini, E., Sullivan, S., Klein, S. Obesity and nonalcoholic fatty liver disease: Biochemical, metabolic, and clinical implications. Hepatology. 51 (2), 679-689 (2010).
- Kristiansen, M. N. B., Veidal, S. S., Christoffersen, C., Jelsing, J., Rigbolt, K. T. G. Molecular characterization of microvesicular and macrovesicular steatosis shows widespread differences in metabolic pathways. Lipids. 54 (1), 109-115 (2019).
- Tsutsumi, V., Nakamura, T., Ueno, T., Torimura, T., Aguirre-García, J., Muriel, P. Chapter 2: Structure and ultrastructure of the normal and diseased liver. Liver Pathophysiology. , 23-44 (2017).
- Tandra, S., et al. Presence and significance of microvesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 55 (3), 654-659 (2011).
- Nascimbeni, F., et al. Clinical relevance of liver histopathology and different histological classifications of NASH in adults. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 351-367 (2018).
- Yerian, L. Histopathological evaluation of fatty and alcoholic liver diseases. Journal of Digestive Diseases. 12 (1), 17-24 (2011).
- Stöppeler, S., et al. Gender and strain-specific differences in the development of steatosis in rats. Laboratory Animals. 47 (1), 43-52 (2013).
- Hübscher, S. G., Saxena, R. Alcohol-induced liver disease. Practical Hepatic Pathology: A Diagnostic Approach (Second Edition). , 371-390 (2018).
- Sethunath, D., et al. Automated assessment of steatosis in murine fatty liver. PLoS One. 13 (5), e0197242 (2018).
- Sinton, M. C., et al. Macrovesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease is a consequence of purine nucleotide cycle driven fumarate accumulation. bioRxiv. , (2020).
- de Conti, A., et al. Characterization of the variability in the extent of nonalcoholic fatty liver induced by a high-fat diet in the genetically diverse collaborative cross mouse model. The FASEB Journal. 34 (6), 7773-7785 (2020).
- Virarkar, M., Szklaruk, J., Jensen, C. T., Taggart, M. W., Bhosale, P. What’s new in hepatic steatosis. Seminars in Ultrasound, CT and MRI. 42 (4), 405-415 (2021).
- Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), e51092 (2012).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 42 (2015).
- Daemen, S., van Zandvoort, M. A. M. J., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2015).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), e77774 (2013).
- Nakano, T., et al. Ezetimibe impairs transcellular lipid trafficking and induces large lipid droplet formation in intestinal absorptive epithelial cells. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1865 (12), 158808 (2020).
- Adomshick, V., Pu, Y., Veiga-Lopez, A. Automated lipid droplet quantification system for phenotypic analysis of adipocytes using CellProfiler. Toxicology Mechanisms and Methods. 30 (5), 378-387 (2020).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Martinez-Lopez, N., Singh, R. Autophagy and lipid droplets in the liver. Annual Review of Nutrition. 35, 215-237 (2015).
- Collot, M., et al. Ultrabright and fluorogenic probes for multicolor imaging and tracking of lipid droplets in cells and tissues. Journal of the American Chemical Society. 140 (16), 5401-5411 (2018).
- Selvais, C. M., De Cock, L. L., Brichard, S. M., Davis-Lopez de Carrizosa, M. A. Fiber type and subcellular-specific analysis of lipid droplet content in skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: Jove. (184), e63718 (2022).
- Zhuang, H., et al. Long-term high-fat diet consumption by mice throughout adulthood induces neurobehavioral alterations and hippocampal neuronal remodeling accompanied by augmented microglial lipid accumulation. Brain, Behavior, and Immunity. 100, 155-171 (2022).
- Chen, J., Yue, F., Kuang, S. Labeling and analyzing lipid droplets in mouse muscle stem cells. STAR Protocols. 3 (4), 101849 (2022).
