我们描述了一种从小型节肢动物中有效收集可量化血淋巴以进行后续分析的方法。
众所周知,节肢动物通过其血淋巴传播各种具有医学和农业重要性的病毒,这对于病毒传播至关重要。血淋巴采集是研究病毒-载体相互作用的基本技术。在这里,我们描述了一种新颖而简单的方法,用于定量收集小型节肢动物的血淋巴,使用 Laodelphax striatellus (小棕色飞虱,SBPH)作为研究模型,因为这种节肢动物是水稻条纹病毒(RSV)的主要载体。在该协议中,该过程首先用细尖镊子轻轻捏掉冷冻节肢动物的一条腿,然后将血淋巴从伤口中压出。然后,根据毛细管力原理,使用由毛细管和移液器灯泡组成的简单微量移液器从伤口收集漏出性血淋巴。最后,可以将收集的血淋巴溶解到特定的缓冲液中以供进一步研究。这种从小型节肢动物收集血淋巴的新方法是进一步研究虫媒病毒和载体-病毒相互作用的有用且有效的工具。
动植物病毒都可以通过节肢动物传播,这些病毒对人类健康构成严重威胁,给农业造成巨大的经济损失1,2,3。重要的是,节肢动物血淋巴作为节肢动物的循环系统和免疫系统的重要组成部分,在调节虫媒病毒传播方面起着重要作用。通过节肢动物肠道获得的病毒只有在成功逃脱不良血淋巴环境后才会转运到其他组织4,5,6,7。节肢动物血淋巴中病毒的生命周期涉及病毒在血浆中存活、进入血细胞并转运到其他组织,血淋巴中发生各种病毒-载体相互作用机制8、9、10、11、12。例如,SBPH 对 RSV 的垂直传播取决于 SBPH 卵黄素蛋白和 RSV(米条纹病毒)衣壳蛋白13,14 之间的分子相互作用。一些病毒可能通过结合特定的载体因子15,16,17,18来逃避血淋巴的免疫反应。因此,研究节肢动物血淋巴中的载体-病毒相互作用对于更好地了解虫媒病毒传播非常重要。
一些小昆虫的血淋巴,如飞虱、叶蝉和一些蚊子,由于其体型的原因,很难收集。为了解决这个问题,已经开发了几种收集血淋巴的方法,包括将注射器针头直接插入昆虫体内以提取微量的血淋巴,用细尖镊子从伤口部位收集渗出物,以及直接离心。这些方法能够测量血淋巴内的相对基因表达水平和病毒滴度19,20,21。然而,对于这些小昆虫,目前还没有一种有效的血淋巴体积定量方法,这是血细胞计数、蛋白质定量和酶活性分析所必需的。
SBPH(小棕色飞虱)是一种体长约2-4毫米的小型昆虫媒介。SBPH能够传播多种植物病毒,包括RSV,玉米粗矮病毒和水稻黑条纹矮病毒22,23,24。在过去十年中,对SBPH和RSV之间的相互作用进行了深入研究。为了便于使用SBPH,我们开发了一种新颖而简单的血淋巴收集方法。这种方法基于毛细管力原理,使用带有刻度标记的毛细管以精确和可量化的方式获取昆虫的血淋巴。这使我们能够有效地从小昆虫中收集特定体积的血淋巴,并更详细地研究小载体的血淋巴环境。
血淋巴是节肢动物循环系统的介质,虫媒病毒只有在恶劣的血淋巴环境中生存下来,才能侵入其他节肢动物组织。收集高质量的血淋巴样本是研究血淋巴中发生的载体-病毒相互作用的第一步。据报道,昆虫血淋巴可以从昆虫身体的几个部位获得,包括前腿上的伤口、头部区域的小切口或腹部的撕裂伤口26、27、28、<sup class="xref"…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了国家重点研发计划(编号:2022YFD1401700)和国家自然科学基金(编号:32090013和32072385)的支持。
10% SDS-PAGE protein gel | Bio-rad | 4561035 | Protein separation and detection |
4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | For fixation of the cells or tissues |
Bradford dye reagent | Bio-rad | 5000205 | Protein concentration detection |
Capillary | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
Cell counting chamber | ACMEC | AYA0810 | Hemocytes counting |
Glass slide | Gitoglas | 10127105A | For holding insects |
Glass slide coated with silane | Sigma | S4651-72EA | For holding microscope samples |
Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Nucleus staining |
Microscope cover glass | Gitoglas | 10212424C | For microscopic observation |
Pipette bulb | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
Prism 8.0 software | GraphPad Software | / | Statistical analyses |
Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | For insect dissection |
Tweezers | Tianld | P5622 | For insect dissection |
Zeiss inverted microscope | Zeiss | Observer Z1 | Hemocytes observation |