Wir beschreiben eine Methode, um quantifizierbare Hämolymphe effizient aus kleinen Arthropoden für die anschließende Analyse zu gewinnen.
Es ist bekannt, dass Gliederfüßer eine Vielzahl von Viren von medizinischer und landwirtschaftlicher Bedeutung durch ihre Hämolymphe übertragen, die für die Virusübertragung unerlässlich ist. Die Hämolymphsammlung ist die Basistechnologie für die Untersuchung von Virus-Vektor-Interaktionen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine neuartige und einfache Methode zur quantitativen Entnahme von Hämolymphen aus kleinen Arthropoden unter Verwendung von Laodelphax striatellus (der kleinen braunen Zikade, SBPH) als Forschungsmodell, da dieser Arthropode der Hauptvektor des Reisstreifenvirus (RSV) ist. Bei diesem Protokoll beginnt der Prozess damit, dass ein Bein des gefrorenen Gliederfüßers mit einer Pinzette mit feiner Spitze sanft abgekniffen und die Hämolymphe aus der Wunde gedrückt wird. Dann wird eine einfache Mikropipette, bestehend aus einer Kapillare und einem Pipettenkolben, verwendet, um die transsudative Hämolymphe nach dem Prinzip der Kapillarkräfte aus der Wunde zu entnehmen. Schließlich kann die gesammelte Hämolymphe zur weiteren Untersuchung in einem spezifischen Puffer aufgelöst werden. Diese neue Methode zur Gewinnung von Hämolymphen aus kleinen Arthropoden ist ein nützliches und effizientes Werkzeug für die weitere Erforschung von Arboviren und Vektor-Virus-Interaktionen.
Sowohl tierische als auch pflanzliche Viren können von Gliederfüßern übertragen werden, und diese Viren stellen eine ernsthafte Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar und verursachen enorme wirtschaftliche Verluste in der Landwirtschaft 1,2,3. Wichtig ist, dass die Arthropoden-Hämolymphe, die als Kreislaufsystem und lebenswichtiges Element des Immunsystems bei Arthropoden dient, eine wichtige Rolle bei der Regulierung der arboviralen Übertragung spielt. Viren, die über den Darm der Arthropoden erworben wurden, werden erst dann in andere Gewebe transportiert, wenn sie der ungünstigen Hämolymphumgebung erfolgreich entkommensind 4,5,6,7. Der Lebenszyklus von Viren in der Arthropoden-Hämolymphe umfasst das Überleben des Virus im flüssigen Plasma, das Eindringen in die Hämozyten und den Transport in andere Gewebe, und in der Hämolymphe treten verschiedene Virus-Vektor-Interaktionsmechanismen auf 8,9,10,11,12. So ist beispielsweise die vertikale Übertragung von RSV durch den SBPH von einer molekularen Interaktion zwischen dem SBPH-Vitellogenin-Protein und dem RSV-Kapsidprotein (Reisstreifenvirus) abhängig13,14. Einige Viren können der Immunantwort der Hämolymphe entgehen, indem sie bestimmte Vektorfaktorenbinden 15,16,17,18. Daher ist die Untersuchung von Vektor-Virus-Interaktionen in der Hämolymphe von Arthropoden wichtig, um ein besseres Verständnis der Arbovirus-Übertragung zu entwickeln.
Die Hämolymphe einiger kleiner Insekten wie Zikaden, Zikaden und einiger Mücken ist aufgrund ihrer Größe schwer zu sammeln. Um dieses Problem anzugehen, wurden verschiedene Methoden zur Hämolymphentnahme entwickelt, darunter das Einführen einer Spritzennadel direkt in den Insektenkörper, um ein Mikrovolumen der Hämolymphe zu extrahieren, das Sammeln von Exsudat aus der Wundstelle mit einer Pinzette mit feiner Spitze und die direkte Zentrifugation. Diese Methoden ermöglichten die Messung der relativen Genexpression und der Virustiter innerhalb der Hämolymphe 19,20,21. Eine effektive Methode zur Quantifizierung des Hämolymphvolumens, die für die Hämolymphzählung, Proteinquantifizierung und Enzymaktivitätsanalyse notwendig ist, steht für diese kleinen Insekten derzeit jedoch nicht zur Verfügung.
Die SBPH (kleine braune Zikade) ist eine Art kleiner Insektenvektor mit einer Körperlänge von etwa 2-4 mm. Der SBPH ist in der Lage, eine Vielzahl von Pflanzenviren zu übertragen, darunter RSV, Mais-Rauhzwergvirus und Reis-Schwarzstreifen-Zwergvirus22,23,24. Die Wechselwirkung zwischen SBPH und RSV wurde in den letzten zehn Jahren eingehend untersucht. Um die Arbeit mit SBPHs zu erleichtern, haben wir eine neuartige und einfache Methode zur Hämolymphentnahme entwickelt. Bei dieser Methode, die auf dem Prinzip der Kapillarkräfte basiert, wird eine Kapillare mit einer Schuppenmarkierung verwendet, um die Hämolymphe des Insekts präzise und quantifizierbar zu erfassen. Dies ermöglicht es uns, ein bestimmtes Volumen an Hämolymphe von kleinen Insekten effizient zu sammeln und die Hämolymphumgebung kleiner Vektoren genauer zu untersuchen.
Hämolymphe ist das Medium des Kreislaufsystems bei Gliederfüßern, und Arboviren können nur dann in andere Gliederfüßergewebe eindringen, wenn sie in der Lage sind, die feindliche Hämolymphumgebung zu überleben. Die Entnahme einer qualitativ hochwertigen Hämolymphprobe ist der erste Schritt zur Untersuchung der Vektor-Virus-Interaktionen, die in der Hämolymphe auftreten. Es wurde berichtet, dass die Insektenhämolymphe an mehreren Stellen des Körpers des Insekts gewonnen werden kann, einschließlich einer Wunde…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom National Key R&D Program of China (Nr. 2022YFD1401700) und von der National Science Foundation of China (Nr. 32090013 und Nr. 32072385) unterstützt.
10% SDS-PAGE protein gel | Bio-rad | 4561035 | Protein separation and detection |
4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | For fixation of the cells or tissues |
Bradford dye reagent | Bio-rad | 5000205 | Protein concentration detection |
Capillary | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
Cell counting chamber | ACMEC | AYA0810 | Hemocytes counting |
Glass slide | Gitoglas | 10127105A | For holding insects |
Glass slide coated with silane | Sigma | S4651-72EA | For holding microscope samples |
Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Nucleus staining |
Microscope cover glass | Gitoglas | 10212424C | For microscopic observation |
Pipette bulb | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
Prism 8.0 software | GraphPad Software | / | Statistical analyses |
Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | For insect dissection |
Tweezers | Tianld | P5622 | For insect dissection |
Zeiss inverted microscope | Zeiss | Observer Z1 | Hemocytes observation |