単核シーケンシングまたは免疫染色のための成体マウス脈条血管の解剖

Summary

脈管筋は内蝸牛電位の生成に不可欠です。ここでは、単核シーケンシングまたは免疫染色のための成体マウス脈条血管の解剖を紹介します。

Abstract

脈管脈によって生成される内蝸牛電位は、適切な有毛細胞のメカノトランスダクション、そして最終的には聴覚を助長する環境を維持するために不可欠です。脈理血管の病状は聴力の低下をもたらす可能性があります。成体脈条血管の解剖は、焦点を絞った単一核捕捉とそれに続く単一核シーケンシングおよび免疫染色を可能にする。これらの技術は、単一細胞レベルで脈理血管の病態生理学を研究するために使用されます。

単一核シーケンシングは、脈管脈の転写解析の設定に使用できます。一方、免疫染色は、細胞の特定の集団を同定するのに引き続き有用です。どちらの方法も、前提条件として適切な脈理血管郭清を必要としますが、これは技術的に困難であることが判明する可能性があります。

Introduction

蝸牛は、スカラ前庭、スカラ中膜、およびスカラティンパニの3つの液体で満たされたチャンバーで構成されています。スカラ前庭とスカラティンパニにはそれぞれ外リンパが含まれており、外リンパには高濃度のナトリウム(138 mM)と低濃度のカリウム(6.8 mM)^{が含まれています1}。スカラ培地には内リンパが含まれており、内リンパには高濃度のカリウム(154 mM)と低濃度のナトリウム(0.91 mM)が含まれています^1,2,3。このイオン濃度の違いは、内蝸牛電位(EP)と呼ぶことができ、主に蝸牛の側壁に沿った脈管線条(SV)^のさまざまなイオンチャネルとギャップ結合を通るカリウムイオンの移動によって生成されます4,5,6,7,8,9,10,11 .SVは、蝸牛の側壁の内側を覆う不均一な高度に血管新生された組織であり、辺縁細胞、中間細胞、基底細胞の3つの主要な細胞タイプが含まれています¹²(図1)。

辺縁細胞はタイトジャンクションによって接続され、SVの最も内側の表面を形成します。頂端膜はスカラ中膜の内リンパに面しており、KCNE1/KCNQ1、SLC12A2、Na⁺–K^+-ATPアーゼ(NKA)5,10,13,14などの様々なチャネルを用いて内リンパへのカリウムイオン輸送に寄与しています。中間細胞は、辺縁細胞と基底細胞の間に存在し、KCNJ10(Kir 4.1)^15,16を用いてSVを介したカリウム輸送を促進する色素細胞である。基底細胞は蝸牛の側壁に近接しており、螺旋靭帯の線維細胞と密接に関連して外リンパからのカリウムリサイクルを促進する¹²。SVの病理は、多数の耳鼻咽喉科疾患に関与している^17,18。Kcnq1、Kcne1、Kcnj10、Cldn11などの主要なSV細胞型で発現する遺伝子の変異は、EP 19,20,21,22,23の喪失を含む難聴およびSV機能障害を引き起こす可能性があります。3つの主要な細胞型に加えて、SVには、紡錘細胞22、根細胞¹²、²⁴、マクロファージ25、周皮細胞26、内皮細胞²⁷など^、イオン恒常性と^EP28の生成を含む役割が不完全に定義された他の細胞タイプがあります。

バルクRNAシーケンシングと比較して、一核RNAシーケンシング(sNuc−Seq)は、細胞群²⁹にわたるmRNAの平均ではなく、細胞の不均一性に関する情報を提供し、異質^SV30を研究する場合に特に有用であり得る。たとえば、sNuc-Seqは、EP生成、難聴、およびメニエール病における紡錘体細胞と根細胞の役割がある可能性があることを示唆する転写分析を作成しました¹⁸。さまざまなSV細胞タイプのさらなる転写特性評価は、SV関連の聴力変動および難聴のさまざまなメカニズムおよびサブタイプの根底にある病態生理学に関する貴重な情報を提供します。これらの繊細な内耳構造の収穫は、最適な組織分析にとって最も重要です。

この研究では、sNuc-Seqまたは免疫染色のために成体マウス蝸牛から脈管線条にアクセスして分離するためのマイクロダイセクションアプローチについて説明します。成体マウスSVの解剖は、様々なSV細胞型を理解し、聴覚におけるそれらの役割をさらに特徴付けるために必要とされる。

Protocol

すべての動物実験および手順は、国立神経疾患および脳卒中研究所の動物管理および使用委員会および国立衛生研究所の難聴およびその他のコミュニケーション障害に関する国立研究所によって承認されたプロトコルに従って実施されました。すべての実験プロトコルは、国立神経疾患および脳卒中研究所の動物管理および使用委員会および国立衛生研究所の国立難聴およびその他のコミュ?…

Representative Results

sNuc-Seqまたは免疫染色に使用するSVを単離する方法を紹介します。SVに関連する蝸牛の関連する解剖学的構造(図1)は、ユーザーがSVの構成と解剖プロトコルのステップをよりよく理解するのに役立ちます。 P30マウスからのSVのこのマイクロダイセクションの各ステップは、関連するビデオで詳しく説明されており、この解剖とSVの分離の主要なステッ?…

Discussion

シングルセルシーケンシングが登場する前は、多くの研究者がバルク組織分析を使用していましたが、細胞全体で平均化されたトランスクリプトームの分析しかできませんでした。特に、単一細胞およびsNuc-Seqは、それぞれ単一細胞または単一核のトランスクリプトームを単離することを可能にした³²。この場合、単一核トランスクリプトームは、辺縁細胞、中間細胞、およ…

Materials

10-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50010-01	Filter tissue during sNuc-Seq
18 x 18 mm cover glass	Fisher Scientific	12-541A	Cover slip to mount SV
30-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50030-03	Filter tissue during sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide	Daigger	EF15978Z	Microslide to mount SV on
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	Used for cell counting
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm	Biomedical Research Instruments	15-1020	Used to transfer SV
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1	Chromium	PN-1000141	Generates single cell 3' gene expression libraries
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Used for sealing SV mount
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well	Corning	08-772B	Culture dish used to hold specimen during dissection
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	Stain used for nucleus labeling
Dounce homogenizer	Sigma-Aldrich	D8938	Used to homogenize tissue for sNuc-seq
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	General forceps for dissection
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Used for steps of sNuc-Seq
Glue stick	Fisher Scientific	NC0691392	Used for mounting SV
GS-IB4 Antibody	Molecular Probes	I21411, RRID: AB-2314662	Antibody used for capillary labeling
KCNJ10-ZsGreen Mice	n/a	n/a	Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	Used for steps of sNuc-Seq
Mounting reagent	ThermoFisher	#S36940	Mounting reagent for SV
Multiwell 24 well plate	Corning	#353047	Plate used for immunostaining
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	Used for steps of sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	Used for steps of sNuc-Seq
Nuclease free water	ThermoFisher	4387936	Used for steps of sNuc-Seq
Orbital shaker	Silent Shake	SYC-2102A	Used for steps of immunostaining
PBS	ThermoFisher	J61196.AP	Used for steps of immunostaining and dissection
RNA Later	Invitrogen	AM7021	Used for preservation of SV for sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	Used for splitting mouse skull
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	Used for steps of sNuc-Seq
Trypan blue stain	Gibco	15250061	Used for cell counting
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	Used for steps of sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope	Zeiss	n/a	Microscope used for dissections