Dissezione della stria vascolare del topo adulto per sequenziamento di singoli nuclei o immunocolorazione

Summary

La stria vasculare è vitale per la generazione del potenziale endococleare. Qui, presentiamo la dissezione della stria vasculare del topo adulto per il sequenziamento a singolo nucleo o l’immunocolorazione.

Abstract

Il potenziale endococleare, generato dalla stria vascolare, è essenziale per mantenere un ambiente favorevole alla meccanotrasduzione delle cellule ciliate appropriate e, infine, all’udito. Le patologie della stria vascolare possono causare una diminuzione dell’udito. La dissezione della stria vascolare adulta consente la cattura focalizzata del singolo nucleo e il successivo sequenziamento e immunocolorazione del singolo nucleo. Queste tecniche sono utilizzate per studiare la fisiopatologia della stria vascolare a livello unicellulare.

Il sequenziamento a singolo nucleo può essere utilizzato nell’ambito dell’analisi trascrizionale della stria vascolare. Nel frattempo, l’immunocolorazione continua ad essere utile nell’identificazione di specifiche popolazioni di cellule. Entrambi i metodi richiedono una corretta dissezione della stria vascolare come prerequisito, che può rivelarsi tecnicamente impegnativa.

Introduction

La coclea è costituita da tre camere piene di liquido, la scala vestibuli, la scala media e la scala tympani. I vestiboli della scala e i timpani della scala contengono ciascuno perilinfa, che ha un’alta concentrazione di sodio (138 mM) e una bassa concentrazione di potassio (6,8 mM)¹. La scala media contiene endolinfa, che ha un’alta concentrazione di potassio (154 mM) e una bassa concentrazione di sodio (0,91 mM)^1,2,3. Questa differenza nella concentrazione di ioni può essere indicata come potenziale endococleare (EP) ed è generata principalmente dal movimento di ioni potassio attraverso vari canali ionici e giunzioni gap nella stria vascolare (SV) lungo la parete laterale della coclea 4,5,6,7,8,9,10,11 . La SV è un tessuto eterogeneo e altamente vascolarizzato che riveste l’aspetto mediale della parete laterale della coclea e contiene tre tipi cellulari principali: cellule marginali, intermedie e basali¹² (Figura 1).

Le cellule marginali sono collegate da giunzioni strette per formare la superficie più mediale della SV. La membrana apicale è rivolta verso l’endolinfa della scala media e contribuisce al trasporto di ioni potassio nell’endolinfa utilizzando vari canali, tra cui KCNE1/KCNQ1, SLC12A2 e Na+–K⁺-ATPasi (NKA)^5,10,13,14. Le cellule intermedie sono cellule pigmentate che risiedono tra le cellule marginali e basali e facilitano il trasporto del potassio attraverso la SV usando KCNJ10 (Kir 4.1)^15,16. Le cellule basali si trovano in prossimità della parete laterale della coclea e sono strettamente associate ai fibrociti del legamento a spirale per promuovere il riciclaggio del potassio dalla perilinfa¹². La patologia della SV è stata implicata in numerosi disturbi otologici^17,18. Le mutazioni nei geni espressi nei principali tipi di cellule SV, come Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 e Cldn11, possono causare sordità e disfunzione SV, inclusa la perdita di EP 19,20,21,22,23. Oltre ai tre principali tipi di cellule, ci sono altri tipi di cellule meno studiati nella SV, come le cellule fusate 22, le cellule radicali^12,24, i macrofagi 25, i periciti 26 e le cellule endoteliali 27^, che hanno ruoli incompletamente definiti che coinvolgono l’omeostasi ionica e la generazione di EP ²⁸.

Rispetto al sequenziamento dell’RNA di massa, il sequenziamento dell’RNA a nucleo singolo (sNuc-Seq) fornisce informazioni sull’eterogeneità cellulare, piuttosto che una media di mRNA in un gruppo di cellule²⁹, e può essere particolarmente utile quando si studia l’eterogeneo SV³⁰. Ad esempio, sNuc-Seq ha prodotto un’analisi trascrizionale che suggerisce che potrebbe esserci un ruolo per le cellule del fuso e della radice nella generazione di EP, nella perdita dell’udito e nella malattia di Meniere¹⁸. Un’ulteriore caratterizzazione trascrizionale dei vari tipi di cellule SV può fornirci informazioni preziose sulla fisiopatologia alla base dei diversi meccanismi e sottotipi di fluttuazione dell’udito correlata alla SV e della perdita dell’udito. La raccolta di queste delicate strutture dell’orecchio interno è di fondamentale importanza per un’analisi ottimale dei tessuti.

In questo studio, viene descritto l’approccio di microdissezione per accedere e isolare la stria vascolare dalla coclea del topo adulto per sNuc-Seq o immunocolorazione. La dissezione della SV del topo adulto è necessaria per comprendere vari tipi di cellule SV e caratterizzare ulteriormente il loro ruolo nell’udito.

Protocol

Tutti gli esperimenti e le procedure sugli animali sono stati eseguiti secondo i protocolli approvati dal Comitato per la cura e l’uso degli animali dell’Istituto nazionale di malattie neurologiche e ictus e dall’Istituto nazionale sulla sordità e altri disturbi della comunicazione, National Institutes of Health. Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dall’Animal Care and Use Committee del National Institute of Neurological Diseases and Stroke e dal National Institute on Deafness and Other Communication Di…

Representative Results

Presentiamo un metodo per isolare la SV da utilizzare per sNuc-Seq o immunocolorazione. L’anatomia rilevante (Figura 1) della coclea rispetto alla SV può aiutare gli utenti a comprendere meglio l’organizzazione della SV e le fasi del protocollo di dissezione. Ogni fase di questa microdissezione di SV da un mouse P30 è dettagliata nel video associato e le istantanee dei passaggi chiave di questa dissezione e isolamento di SV sono presentate nella <strong class="x…

Discussion

Prima dell’avvento del sequenziamento a singola cellula, molti ricercatori utilizzavano l’analisi dei tessuti di massa, che consentiva solo di analizzare i trascrittomi mediati tra le cellule. In particolare, single-cell e sNuc-Seq hanno permesso di isolare il trascrittoma di una singola cellula o di un singolo nucleo, rispettivamente³². In questo caso, i trascrittomi a singolo nucleo possono essere identificati per le cellule marginali, intermedie e basali, così come le cellule del fuso<sup clas…

Materials

10-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50010-01	Filter tissue during sNuc-Seq
18 x 18 mm cover glass	Fisher Scientific	12-541A	Cover slip to mount SV
30-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50030-03	Filter tissue during sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide	Daigger	EF15978Z	Microslide to mount SV on
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	Used for cell counting
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm	Biomedical Research Instruments	15-1020	Used to transfer SV
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1	Chromium	PN-1000141	Generates single cell 3' gene expression libraries
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Used for sealing SV mount
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well	Corning	08-772B	Culture dish used to hold specimen during dissection
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	Stain used for nucleus labeling
Dounce homogenizer	Sigma-Aldrich	D8938	Used to homogenize tissue for sNuc-seq
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	General forceps for dissection
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Used for steps of sNuc-Seq
Glue stick	Fisher Scientific	NC0691392	Used for mounting SV
GS-IB4 Antibody	Molecular Probes	I21411, RRID: AB-2314662	Antibody used for capillary labeling
KCNJ10-ZsGreen Mice	n/a	n/a	Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	Used for steps of sNuc-Seq
Mounting reagent	ThermoFisher	#S36940	Mounting reagent for SV
Multiwell 24 well plate	Corning	#353047	Plate used for immunostaining
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	Used for steps of sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	Used for steps of sNuc-Seq
Nuclease free water	ThermoFisher	4387936	Used for steps of sNuc-Seq
Orbital shaker	Silent Shake	SYC-2102A	Used for steps of immunostaining
PBS	ThermoFisher	J61196.AP	Used for steps of immunostaining and dissection
RNA Later	Invitrogen	AM7021	Used for preservation of SV for sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	Used for splitting mouse skull
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	Used for steps of sNuc-Seq
Trypan blue stain	Gibco	15250061	Used for cell counting
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	Used for steps of sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope	Zeiss	n/a	Microscope used for dissections