הסטריה וסקולריס חיונית ליצירת הפוטנציאל האנדוקוכליארי. כאן, אנו מציגים את הדיסקציה של העכבר הבוגר stria vascularis עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining.
הפוטנציאל האנדוקוכליארי, אשר נוצר על ידי כלי הדם stria, הוא חיוני כדי לשמור על סביבה תורמת mechanotransduction תאי שיער מתאים ובסופו של דבר שמיעה. פתולוגיות של כלי הדם stria יכול לגרום לירידה בשמיעה. דיסקציה של הסטריה וסקולריס הבוגרת מאפשרת לכידה ממוקדת של גרעין יחיד ולאחר מכן ריצוף גרעין יחיד וצביעת חיסון. טכניקות אלה משמשות לחקר פתופיזיולוגיה של סטריה וסקולריס ברמת התא היחיד.
ריצוף גרעין יחיד יכול לשמש בהגדרה של ניתוח שעתוק של כלי הדם stria. בינתיים, צביעת מערכת החיסון ממשיכה להיות שימושית בזיהוי אוכלוסיות ספציפיות של תאים. שתי השיטות דורשות דיסקציה נכונה של stria vascularis כתנאי מוקדם, אשר יכול להוכיח להיות מאתגר מבחינה טכנית.
השבלול מורכב משלושה תאים מלאים בנוזל, סקאלה וסטיבולי, סקאלה מדיה וסקלה טימפני. סקאלה וסטיבולי וסקלה טימפאני מכילים כל אחד פרילימפה, אשר יש ריכוז גבוה של נתרן (138 mM) וריכוז נמוך של אשלגן (6.8 mM)1. מדיה סקאלה מכיל endolymph, אשר יש ריכוז גבוה של אשלגן (154 mM) וריכוז נמוך של נתרן (0.91 mM)1,2,3. הבדל זה בריכוז היונים יכול להיקרא פוטנציאל אנדוקוכליארי (EP), והוא נוצר בעיקר על ידי תנועה של יוני אשלגן דרך תעלות יונים שונות וצמתים מרווחים בסטריה וסקולריס (SV) לאורך הדופן הצידית של השבלול 4,5,6,7,8,9,10,11 . SV היא רקמה הטרוגנית, מאוד וסקולרית, שמרפדת את האספקט המדיאלי של הדופן הצידית של השבלול ומכילה שלושה סוגי תאים עיקריים: תאים שוליים, תאי ביניים ותאי בסיס12 (איור 1).
תאי שוליים מחוברים על ידי צמתים הדוקים כדי ליצור את המשטח המדיאלי ביותר של SV. הממברנה האפיקלית פונה לאנדולימפה של מדיה סקאלה ותורמת להעברת יוני אשלגן לתוך האנדולימפה באמצעות ערוצים שונים, כולל KCNE1/KCNQ1, SLC12A2 ו-Na+-K+-ATPase (NKA)5,10,13,14. תאי ביניים הם תאים פיגמנטיים השוכנים בין תאים שוליים לתאי בסיס ומאפשרים העברת אשלגן דרך SV באמצעות KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. תאי הבסיס נמצאים בסמיכות לדופן הצידית של השבלול וקשורים קשר הדוק עם פיברוציט של הרצועה הספירלית כדי לקדם מחזור אשלגן מהפרילימפה12. פתולוגיה של SV הייתה מעורבת בהפרעות אוטולוגיות רבות17,18. מוטציות בגנים המתבטאים בסוגי תאי SV העיקריים, כגון Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 ו-Cldn11, עלולות לגרום לחירשות ולתפקוד לקוי של SV, כולל אובדן EP 19,20,21,22,23. בנוסף לשלושת סוגי התאים העיקריים, ישנם סוגי תאים אחרים פחות נחקרים ב-SV, כגון תאי ציר 22, תאי שורש12,24, מקרופאגים 25, פריציטים 26 ותאי אנדותל 27, שיש להם תפקידים לא מוגדרים לחלוטין הקשורים להומאוסטזיס יוני וליצירת EP 28.
בהשוואה לריצוף רנ”א בתפזורת, ריצוף רנ”א חד-גרעיני (sNuc-Seq) מספק מידע על הטרוגניות התא, ולא ממוצע של mRNA על פני קבוצת תאים29, ויכול להיות שימושי במיוחד כאשר חוקרים את SV30 ההטרוגני. לדוגמה, sNuc-Seq הפיק ניתוח שעתוק המצביע על כך שייתכן שיש תפקיד לתאי ציר ושורש ביצירת EP, אובדן שמיעה ומחלת מנייר18. אפיון שעתוק נוסף של סוגי תאי SV השונים יכול לספק לנו מידע רב ערך על הפתופיזיולוגיה העומדת בבסיס מנגנונים ותת-סוגים שונים של תנודות שמיעה הקשורות ל-SV ואובדן שמיעה. הקציר של מבני האוזן הפנימית העדינים הללו הוא בעל חשיבות עליונה לניתוח רקמות אופטימלי.
במחקר זה מתוארת גישת המיקרודיסקציה לגישה ולבידוד של כלי הדם הסטריה משברלול העכבר הבוגר עבור sNuc-Seq או immunostaining. דיסקציה של SV עכבר בוגר נדרשת כדי להבין סוגים שונים של תאי SV ולאפיין עוד יותר את תפקידם בשמיעה.
לפני הופעתו של ריצוף תא יחיד, חוקרים רבים השתמשו בניתוח רקמות בתפזורת, אשר איפשר רק לנתח תעתיקים ממוצעים על פני תאים. בפרט, תא בודד ו- sNuc-Seq אפשרו לבודד את התעתיק של תא בודד או גרעין יחיד, בהתאמה32. במקרה זה, ניתן לזהות תעתיקי גרעין יחיד עבור תאים שוליים, בינוניים ובזאליים, כמו גם ת?…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר האינטרמורלית של ה-NIH, NIDCD to M.H. (DC000088)
10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |