Tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için yetişkin fare stria vascularis'in diseksiyonu
Summary
Stria vascularis, endokoklear potansiyelin oluşumu için hayati öneme sahiptir. Burada, yetişkin fare stria vascularis’in tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için diseksiyonu sunulmuştur.
Abstract
Stria vascularis tarafından üretilen endokoklear potansiyel, uygun saç hücresi mekanotransdüksiyonuna ve nihayetinde işitmeye elverişli bir ortamı korumak için gereklidir. Stria vascularisin patolojileri işitmenin azalmasına neden olabilir. Erişkin stria vaskülarisin diseksiyonu, odaklanmış tek çekirdekli yakalamaya ve ardından tek çekirdekli dizileme ve immün boyamaya izin verir. Bu teknikler stria vascularis patofizyolojisini tek hücre düzeyinde incelemek için kullanılır.
Tek çekirdekli dizileme, stria vascularisin transkripsiyonel analizi ayarında kullanılabilir. Bu arada, immün boyama, spesifik hücre popülasyonlarını tanımlamada yararlı olmaya devam etmektedir. Her iki yöntem de ön koşul olarak uygun stria vascularis diseksiyonu gerektirir ve bu da teknik olarak zor olabilir.
Introduction
Koklea sıvı dolu üç odadan oluşur: scala vestibuli, scala media ve scala timpani. Scala vestibuli ve scala timpaninin her biri, yüksek konsantrasyonda sodyum (138 mM) ve düşük konsantrasyonda potasyum (6,8 mM)1 içeren perilenf içerir. Scala ortamı, yüksek konsantrasyonda potasyum (154 mM) ve düşük konsantrasyonda sodyum (0,91 mM)1,2,3 içeren endolenf içerir. İyon konsantrasyonundaki bu fark endokoklear potansiyel (EP) olarak adlandırılabilir ve esas olarak potasyum iyonlarının çeşitli iyon kanalları ve stria vascularis’teki (SV) boşluk kavşakları boyunca kokleanın lateral duvarı boyunca hareketi ile üretilir 4,5,6,7,8,9,10,11 . SV, kokleanın lateral duvarının medial yönünü kaplayan heterojen, yüksek vaskülarize bir dokudur ve üç ana hücre tipi içerir: marjinal, orta ve bazal hücreler12 (Şekil 1).
Marjinal hücreler, SV’nin en medial yüzeyini oluşturmak için sıkı bağlantılarla bağlanır. Apikal membran, scala media’nın endolenfine bakar ve KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 ve Na + –K + -ATPaz (NKA) 5,10,13,14 dahil olmak üzere çeşitli kanalları kullanarak endolenf içine potasyum iyonu taşınmasına katkıda bulunur. Ara hücreler, marjinal ve bazal hücreler arasında bulunan ve KCNJ10 (Kir 4.1)15,16 kullanarak SV yoluyla potasyum taşınmasını kolaylaştıran pigmentli hücrelerdir. Bazal hücreler kokleanın lateral duvarına yakın bir yerde bulunur ve perilenf12’den potasyum geri dönüşümünü teşvik etmek için spiral ligamentin fibrositleri ile yakından ilişkilidir. SV’nin patolojisi çok sayıda otolojik bozuklukla ilişkilendirilmiştir17,18. Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 ve Cldn11 gibi majör SV hücre tiplerinde eksprese edilen genlerdeki mutasyonlar, EP 19,20,21,22,23 kaybı da dahil olmak üzere sağırlık ve SV disfonksiyonuna neden olabilir. Üç ana hücre tipine ek olarak, SV’de, iğ hücreleri 22, kök hücreler12,24, makrofajlar 25, perisitler 26 ve endotel hücreleri 27 gibi, iyonik homeostazı ve EP 28 oluşumunu içeren eksik tanımlanmış rollere sahip daha az çalışılmış başka hücre tipleri de vardır.
Toplu RNA dizilimine kıyasla, tek çekirdekli RNA dizilimi (sNuc-Seq), bir grup hücre29’daki mRNA’nın ortalamasından ziyade hücre heterojenliği hakkında bilgi sağlar ve heterojen SV30’u incelerken özellikle yararlı olabilir. Örneğin, sNuc-Seq, EP üretiminde, işitme kaybında ve Meniere hastalığında iğ ve kök hücrelerin rolü olabileceğini düşündüren transkripsiyonel analiz üretmiştir18. Çeşitli SV hücre tiplerinin daha ileri transkripsiyonel karakterizasyonu, SV ile ilişkili işitme dalgalanması ve işitme kaybının farklı mekanizmalarının ve alt tiplerinin altında yatan patofizyoloji hakkında bize paha biçilmez bilgiler sağlayabilir. Bu hassas iç kulak yapılarının toplanması, optimal doku analizi için büyük önem taşımaktadır.
Bu çalışmada, sNuc-Seq veya immün boyama için stria vaskülaris’e erişen ve izole eden yetişkin fare kokleasından izole etmek için mikrodiseksiyon yaklaşımı tanımlanmıştır. Yetişkin fare SV’nin diseksiyonu, çeşitli SV hücre tiplerini anlamak ve işitmedeki rollerini daha da karakterize etmek için gereklidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tek hücreli dizilemenin ortaya çıkmasından önce, birçok araştırmacı toplu doku analizi kullandı, bu da sadece hücreler arasında ortalama transkriptomları analiz etmeyi mümkün kıldı. Özellikle, tek hücreli ve sNuc-Seq, sırasıyla tek bir hücrenin veya tek çekirdeğin transkriptomunu izole etmeyi mümkün kılmıştır32. Bu örnekte, marjinal, ara ve bazal hücrelerin yanı sıra iğ hücreleri30 için tek çekirdekli transkriptomlar tanımlanabilir. Bu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma kısmen NIH’nin Intramural Araştırma Programı, NIDCD to M.H. (DC000088) tarafından desteklenmiştir
Materials
| 10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
| 30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
| Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
| Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
| Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
| Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
| DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
| GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
| KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
| MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
| Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
| Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
| NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
| PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
| RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
| Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
| Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
| Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |
References
- Bosher, S. K., Warren, R. L. Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 171 (1023), 227-247 (1968).
- Patuzzi, R. Ion flow in stria vascularis and the production and regulation of cochlear endolymph and the endolymphatic potential. Hearing Research. 277 (1-2), 4-19 (2011).
- Wangemann, P. K+ cycling and the endocochlear potential. Hearing Research. 165 (1-2), 1-9 (2002).
- Adachi, N., et al. The mechanism underlying maintenance of the endocochlear potential by the K+ transport system in fibrocytes of the inner ear. The Journal of Physiology. 591 (18), 4459-4472 (2013).
- Hibino, H., Nin, F., Tsuzuki, C., Kurachi, Y. How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus. Pflugers Archiv. 459 (4), 521-533 (2010).
- Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 293 (4), C1187-C1208 (2007).
- Liu, W., Schrott-Fischer, A., Glueckert, R., Benav, H., Rask-Andersen, H. The human "cochlear battery"-claudin-11 barrier and ion transport proteins in the lateral wall of the cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 239 (2017).
- Marcus, D. C., Wu, T., Wangemann, P., Kofuji, P. KCNJ10 (Kir4.1) potassium channel knockout abolishes endocochlear potential. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (2), C403-C407 (2002).
- Spicer, S. S., Schulte, B. A. Differentiation of inner ear fibrocytes according to their ion transport related activity. Hearing Research. 56 (1-2), 53-64 (1991).
- Wangemann, P., Liu, J., Marcus, D. C. Ion transport mechanisms responsible for K+ secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro. Hearing Research. 84 (1-2), 19-29 (1995).
- Yoshida, T., et al. The unique ion permeability profile of cochlear fibrocytes and its contribution to establishing their positive resting membrane potential. Pflugers Archiv. 468 (9), 1609-1619 (2016).
- Johns, J. D., Adadey, S. M., Hoa, M. The role of the stria vascularis in neglected otologic disease. Hearing Research. 428, 108682 (2023).
- Kim, J., Ricci, A. J. In vivo real-time imaging reveals megalin as the aminoglycoside gentamicin transporter into cochlea whose inhibition is otoprotective. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (9), e2117846119 (2022).
- Zdebik, A. A., Wangemann, P., Jentsch, T. J. Potassium ion movement in the inner ear: insights from genetic disease and mouse models. Physiology. 24, 307-316 (2009).
- Chen, J., Zhao, H. B. The role of an inwardly rectifying K+ channel (Kir4.1) in the inner ear and hearing loss. Neuroscience. 265, 137-146 (2014).
- Steel, K. P., Barkway, C. Another role for melanocytes: their importance for normal stria vascularis development in the mammalian inner ear. Development. 107 (3), 453-463 (1989).
- Ito, T., Nishio, A., Wangemann, P., Griffith, A. J. Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome. Neuroscience. 310, 188-197 (2015).
- Gu, S., et al. Characterization of rare spindle and root cell transcriptional profiles in the stria vascularis of the adult mouse cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 18100 (2020).
- Gow, A., et al. Deafness in claudin 11-null mice reveals the critical contribution of basal cell tight junctions to stria vascularis function. The Journal of Neuroscience. 24 (32), 7051-7062 (2004).
- Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Molecular Medicine. 7 (8), 1077-1086 (2015).
- Faridi, R., et al. Mutational and phenotypic spectra of KCNE1 deficiency in Jervell and Lange-Nielsen Syndrome and Romano-Ward Syndrome. Human Mutation. 40 (2), 162-176 (2019).
- Wangemann, P., et al. Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model. BMC Medicine. 2, 30 (2004).
- Kitajiri, S. -. I., et al. Expression patterns of claudins, tight junction adhesion molecules, in the inner ear. Hearing Research. 187 (1-2), 25-34 (2004).
- Jagger, D. J., Nevill, G., Forge, A. The membrane properties of cochlear root cells are consistent with roles in potassium recirculation and spatial buffering. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (3), 435-448 (2010).
- Ito, T., Kurata, N., Fukunaga, Y. Tissue-resident macrophages in the stria vascularis. Frontiers in Neurology. 13, 818395 (2022).
- Zhang, J., et al. VEGFA165 gene therapy ameliorates blood-labyrinth barrier breakdown and hearing loss. JCI Insight. 6 (8), e143285 (2021).
- Shi, X. Pathophysiology of the cochlear intrastrial fluid-blood barrier (review). Hearing Research. 338, 52-63 (2016).
- Gu, S., et al. Identification of potential Meniere’s disease targets in the adult stria vascularis. Frontiers in Neurology. 12, 630561 (2021).
- Fischer, J., Ayers, T. Single nucleus RNA-sequencing: how it’s done, applications and limitations. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (5), 687-690 (2021).
- Korrapati, S., et al. Single cell and single nucleus RNA-Seq reveal cellular heterogeneity and homeostatic regulatory networks in adult mouse stria vascularis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 316 (2019).
- Pyle, M. P., Hoa, M. Applications of single-cell sequencing for the field of otolaryngology: A contemporary review. Laryngoscope Investigative Otolaryngology. 5 (3), 404-431 (2020).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
- Shafer, M. E. R. Cross-species analysis of single-cell transcriptomic data. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 175 (2019).
- Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-Seq technologies and related computational data analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
- Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561 (2016).
