A respirometria coulométrica é ideal para medir a taxa metabólica de pequenos organismos. Quando adaptado para Drosophila melanogaster no presente estudo, o consumo medido de O2 estava dentro da faixa relatada para D. melanogaster selvagem por estudos anteriores. O consumo por mosca O2 pelos mutantes CAS , que são menores e menos ativos, foi significativamente menor do que o selvagem.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Mensuração do Consumo de O2 em Drosophila melanogaster Utilizando Microrrespirometria Coulométrica
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A microrrespirometria coulométrica é um método simples e barato para medir o consumo de O2 de pequenos organismos, mantendo um ambiente estável. Um microrrespirômetro coulométrico consiste em uma câmara hermética na qual o O 2 é consumido e o CO2 produzido pelo organismo é removido por um meio absorvente. A diminuição de pressão resultante desencadeia a produção eletrolítica de O 2, e a quantidade de O2 produzida é medida registrando-se a quantidade de carga usada para gerá-la. No presente estudo, o método foi adaptado para Drosophila melanogaster testado em pequenos grupos, com a sensibilidade do aparelho e as condições ambientais otimizadas para alta estabilidade. A quantidade de O2 consumida por moscas selvagens neste aparelho é consistente com a medida por estudos anteriores. O consumo deO2 específico em massa pelos mutantes CARSK, que são menores e sabidamente menos ativos, não foi diferente dos controles congênicos. No entanto, o pequeno tamanho dos mutantes CASK resultou em uma redução significativa no consumo de O2 por mosca. Portanto, o microrrespirômetro é capaz de medir o consumo de O2 em D. melanogaster, pode distinguir diferenças modestas entre genótipos e adiciona uma ferramenta versátil para medir taxas metabólicas.
Introdução
A capacidade de medir a taxa metabólica é crucial para uma compreensão completa de um organismo em seu contexto ambiental. Por exemplo, é necessário medir a taxa metabólica para entender seu papel no tempo de vida1, o papel da dieta no metabolismo2 ou o limiar para o estresse hipóxico3.
Existem duas abordagens gerais para medir a taxa metabólica4. A calorimetria direta mede o gasto energético diretamente medindo a produção de calor. A calorimetria indireta mede a produção de energia por outros meios, muitas vezes por meio da medição respirométric....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Criação e coleta de moscas
- Manter as moscas a 25 °C em frascos para injetáveis estreitos contendo alimentos padrão de Drosophila .
NOTA: O tamanho da amostra para cada genótipo deve incluir pelo menos nove repetições, cada uma consistindo de uma única câmara respiratória contendo 15-25 moscas, configuradas conforme descrito abaixo. - Transfira as moscas a cada 2-3 dias.
- Anestesiar moscas com CO2, coletar grupos de 15-25 machos de cada genótipo e colocar cada grupo em frascos de alimentos frescos e não fermentados.
NOTA: Os machos foram usados para reduzir a variabilidade devido ao status reprodu....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
As saídas de pressão e corrente do controlador do respirômetro são mostradas para uma câmara em um experimento na Figura 3A. O primeiro pulso de corrente longa pressurizou a câmara da pressão ambiente (aproximadamente 992 hPa) até o limiar OFF pré-estabelecido de 1017 hPa. À medida que as moscas consumiam O 2 e CO 2 era absorvido, a pressão diminuía lentamente até atingir o limiar de ON de 1016 hPa, que ativava a corrente através do gerador de O2. No exemplo .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O procedimento acima demonstra a medição do consumo de O2 em D. Melanogaster usando um microrrespirômetro coulométrico eletrônico. Os dados resultantes para o consumo de O2 em D. melanogaster selvagem estavam dentro dos intervalos descritos na maioria das publicações anteriores usando diversos métodos (Tabela 1), embora um pouco menores do que os relatados por outros 3,6.
As etap.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos à Dra. Linda Restifo da Universidade do Arizona por sugerir testar o consumo de O2 de mutantes CASK e por enviar mutantes CASK e seus controles congênicos. As taxas de publicação foram fornecidas pelo Fundo de Reinvestimento Departamental do Departamento de Biologia da Universidade de College Park. O espaço e alguns equipamentos foram fornecidos pelas Universidades de Shady Grove.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Adaptador de Termômetro 19/22 | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 gerador |
| Conector de 2 pinos | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 gerador: cortado para conector fêmea de 4 pinos de 2 pinos |
| de | sensor | TE Connectivity | 215299-4 |
| 5 ml Tubo de Polipropileno | Falcon | 352063 | Corte até 5,5 cm e perfurado |
| Tubo Schlenk de 50 ml 19/22 Junta | Laboy | HMF050804 | Câmara |
| 6 condutores | Zenith | 6-Condutor Cabo de 26 ga | |
| Conector de anteparo fêmea de 6 pinos | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controlador |
| Conector fêmea de 6 pinos | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Plugue do sensor |
| Conector macho de 6 pinos | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cabo |
| 800 ul tubo de centrífuga | Fisher | 05-408-120 | Cartucho de cal sodada |
| ABS Caixa de plástico Bud | Industries | PS-11533-G | Controlador |
| Arduino Nano Cada | Arduino LLC | Controlador ABX00028 | |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Placa de Circuito | Lheng | Controlador de 5 X 7 cm | |
| Sulfato de Cobre | BioPharm | BC2045 | O2 |
| Gerador Computador | Azulle | Byte4 | Aquisição de Dados |
| Rolos de Algodão | Kajukajudo | #2 | Corte ao meio para tampar os tubos de mosca Corte em quartos para umidade |
| Câmara Ambiental | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Eletrodos seguros em O2 Gerador |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Protege a junta de vidro da câmara para conectar |
| Epoxy de baixa viscosidade | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controlador |
| Fio de platina 24 ga | uGems | 14349 | O2 gerador |
| Graxa de silicone | Dow-Corning | Vedação de graxa de alto vácuo | conexão de plugue de câmara Soda |
| Cal sódio Jorvet | JO553 | CO2 absorção | |
| Chave seletora | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controlador |
| USB | Sabrent | CB-UM63 | Controlador |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Conecte os controladores ao computador |
| Banho-maria | Amersham | 56-1165-33 Controle de | temperatura |
| Tanque de banho-maria | Gaiolas de vidro | acrílico sem aro de 15 litros | para respirômetros |
Referências
- Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
- Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
