전기량 미세호흡계를 사용한 초파리 멜라노가스터의O2 소비량 측정
Summary
전기량 호흡 측정법은 작은 유기체의 신진대사율을 측정하는 데 이상적입니다. 본 연구에서 Drosophila melanogaster에 대해 적응시켰을 때, 측정된O2 소비량은 이전 연구에서 야생형 D. melanogaster에 대해 보고된 범위 내에 있었습니다. 더 작고 덜 활동적인 CASK 돌연변이의 플라이당 O2 소비량은 야생형보다 현저히 낮았습니다.
Abstract
전기량 미세호흡계는 안정적인 환경을 유지하면서 작은 유기체의O2 소비량을 측정하기 위한 간단하고 저렴한 방법입니다. 전기량 마이크로 호흡계는 O 2 가 소비되고 유기체에 의해 생성 된 CO2 가 흡수 매체에 의해 제거되는 밀폐 챔버로 구성됩니다. 결과적인 압력 감소는 전해 O2 생성을 유발하고, 생성된O2의 양은 이를 생성하는 데 사용된 전하량을 기록하여 측정됩니다. 본 연구에서 이 방법은 장치의 감도와 높은 안정성을 위해 최적화된 환경 조건으로 소그룹으로 테스트된 Drosophila melanogaster에 적용되었습니다. 이 장치에서 야생형 파리가 소비하는O2의 양은 이전 연구에서 측정한 양과 일치합니다. 크기가 작고 덜 활성화되는 것으로 알려진 CASK 돌연변이에 의한 질량 특이적O2 소비는 동종 대조군과 다르지 않았습니다. 그러나, CASK 돌연변이의 크기가 작기 때문에 플라이당 O2 소비가 현저히 감소하였다. 따라서 미세 호흡계는 D. melanogaster에서 O2 소비량을 측정 할 수 있으며 유전자형 간의 적당한 차이를 구별 할 수 있으며 대사율을 측정하기위한 다목적 도구를 추가합니다.
Introduction
신진대사율을 측정하는 능력은 환경적 맥락에서 유기체를 완전히 이해하는 데 매우 중요합니다. 예를 들어, 신진대사율이 수명1에서 차지하는 역할, 신진대사에서 식이요법의 역할2 또는 저산소 스트레스3의 역치를 이해하기 위해서는 신진대사율을 측정할 필요가 있다.
신진대사율을 측정하는 방법에는 두 가지가 있다4. 직접 열량계는 열 생산을 측정하여 에너지 소비를 직접 측정합니다. 간접 열량계는 종종 O 2 소비 (VO2), CO2 생산 또는 둘 다의 호흡 측정 측정을 통해 다른 수단을 통해 에너지 생산을 측정합니다. 직접 열량계는 Drosophila melanogaster5를 포함한 작은 외온에 적용되었지만 호흡 측정법은 기술적으로 더 간단하고 일반적으로 사용됩니다.
야생형 및 돌연변이 D. melanogaster의 대사율을 측정하기 위해 여러 형태의 호흡 측정법이 성공적으로 사용되었으며, 체온6, 사회적 환경3, 식이요법3,7 및 신경발달장애8의 대사 효과에 대한 통찰력을 제공하였다. 이들은 비용과 복잡성이 상당히 다른 두 가지 클래스로 나뉩니다. 압력계는 가장 간단하고 가장 저렴한 9,10으로, 파리를 CO 2 흡수제를 포함하고 얇은 모세관을 통해 유체 저장소에 연결된 밀폐 된 챔버에 넣습니다. O2가 소비되고CO2가 흡수됨에 따라 챔버 내의 압력이 감소하고 유체가 모세관으로 유입됩니다. 따라서 모세관의 유체 충전 부피는 VO2에 비례합니다. 모세관의 유체에 의해 가해지는 힘을 보상하는보다 정교한 버전도 D. melanogaster1에 사용되었습니다. 압력계는 간단하고 저렴하다는 장점이 있지만 압력에 민감하기 때문에 일정한 환경 조건이 필요합니다. 또한, 소비된 O2가 치환되지 않기 때문에, 챔버 내부에서 O2(PO2)의 분압이 서서히 감소한다.
가스 분석을 이용한 호흡 측정법은 D. melanogaster에도 정기적으로 사용됩니다. 이 경우, 가스는 파리를 포함하는 밀폐된 챔버로부터 일정한 간격으로 샘플링되어 적외선 분석기(2,6,11)로 보내진다. 이러한 유형의 장치는 상업적으로 이용 가능하고 환경 조건에 덜 민감하며 샘플링 중에 가스가 새로 고쳐져 PO2가 안정적으로 유지된다는 장점이 있습니다. 그러나 장비는 비싸고 작동이 복잡할 수 있습니다.
최근에 개발된 전기량 마이크로 호흡계(12)는 기존 시스템에 대한 저렴하고 민감하며 안정적인 대안을 제공합니다. 실제로, 유기체는 밀폐 챔버에 배치되어 O 2 를 소비하고 호기 된 CO2 는 흡수성 물질에 의해 제거되어 챔버 압력이 순 감소합니다. 내부 압력이 사전 설정된 임계값(ON 임계값)으로 감소하면 전류가 전해 O2 발생기를 통과하여 압력을 두 번째 임계값(OFF 임계값)으로 되돌려 전기분해를 중지합니다. O2 발생기를 통한 전하 전달은 챔버를 재가압하는 데 필요한 O2의 양에 정비례하며, 따라서 유기체4에 의해 소비되는O2를 측정하는데 사용될 수있다. 이 방법은 매우 민감하고 V O2를 정밀하게 측정하며 O2 를 정기적으로 교체하면 몇 시간 또는 며칠 동안 PO2를 거의 일정한 수준으로 유지할 수 있습니다.
이 연구에 사용된 전기량 미세 호흡계는 다중 모드(압력, 온도 및 습도) 전자 센서를 사용합니다. 센서는 압력의 작은 변화를 감지하고 저압 임계값에 도달하면 O2 생성을 활성화하는 마이크로컨트롤러에 의해 작동됩니다(12). 이 장치는 기성품 부품으로 조립되며 다양한 챔버 및 실험 환경에서 사용할 수 있으며 딱정벌레 Tenebrio molitor에 대한 체질량 및 온도의 영향을 조사하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 본 연구에서, 미세 호흡계는 T. molitor 질량의 약 1%를 갖는 D. melanogaster에서O2 소비량을 측정하도록 조정되었습니다. O2 발생을 활성화하기 위한 임계값을 낮춤으로써 장치의 감도를 높였으며, 온도 제어 수조에서 실험을 수행하거나 챔버 내부의 습도를 100% 또는 그 부근으로 유지함으로써 환경 안정성을 높였습니다.
막 관련 구아닐레이트 키나아제(MAGUK) 계열의 일부인 CASK(Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase) 단백질은 다양한 다중 단백질 복합체의 분자 스캐폴드이며 CASK의 돌연변이는 인간 및 D. melanogaster13,14의 신경 발달 장애와 관련이 있습니다. 생존 가능한 D. 멜라노가스터 돌연변이인 CASKΔ18은 도파민성 뉴런(15)의 활성을 방해하고 동종 대조군에 비해 활동 수준을 50% 이상 감소시킨다(14,16). CASK 돌연변이의 감소된 활성 수준과 신진대사 조절에 있어 카테콜아민의 역할로 인해17 우리는 표준 대사율, 즉O2 소비가 대조군에 비해 극적으로 감소할 것이라는 가설을 세웠다.
O2 소비량은 CASKΔ18 및 이들의 야생형 동족체 w(ex33)에서 측정하였다. 파리 그룹을 호흡 측정 챔버에 배치하고, O 2 소비량을 측정하고, O2 소비량을 계산하여 질량 특이적 및 파리 당 기준으로 표현했습니다. 이 장치는 이전 연구와 일치하는 야생형 파리에서 VO2를 기록했으며 야생형 파리와 CASK 돌연변이 파리의 파리당 O2 소비를 구별할 수 있었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
위의 절차는 전자 전기량 미세 호흡계를 사용하여 D. Melanogaster에서O2 소비량을 측정하는 방법을 보여줍니다. 야생형 D. melanogaster에서의O2 소비에 대한 결과 데이터는 다른 사람들에 의해 보고된 것보다 다소 낮지만(표 1) 다양한 방법을 사용하여 대부분의 이전 간행물에서 기술된 범위 내에 있었다 3,6.
<p class=…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
애리조나 대학의 Linda Restifo 박사가 CASK 돌연변이의O2 섭취 테스트를 제안하고 CASK 돌연변이와 그 유전자 대조군을 보내준 것에 대해 감사드립니다. 출판비는 University of College Park의 생물학과에서 부서별 재투자 기금으로 제공되었습니다. 공간과 일부 장비는 Shady Grove의 대학에서 제공했습니다.
Materials
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
Referências
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