Измерение потребленияO2 у Drosophila melanogaster с помощью кулонометрической микрореспирометрии
Summary
Кулонометрическая респирометрия идеально подходит для измерения скорости метаболизма мелких организмов. При адаптации к Drosophila melanogaster в настоящем исследовании измеренное потреблениеO2 было в пределах диапазона, о котором сообщалось для дикого типа D. melanogaster в предыдущих исследованиях. ПотреблениеO2 мухой мутантами CASK , которые меньше по размеру и менее активны, было значительно ниже, чем у дикого типа.
Abstract
Кулонометрическая микрореспирометрия является простым и недорогим методом измерения потребленияO2 мелкими организмами при сохранении стабильной среды. Кулонометрический микрореспирометр состоит из герметичной камеры, в которой расходуется О2, а вырабатываемый организмомСО2 удаляется абсорбирующей средой. Результирующее снижение давления запускает производство электролитического O2, а количество произведенногоO2 измеряется путем регистрации количества заряда, использованного для его генерации. В настоящем исследовании метод был адаптирован к Drosophila melanogaster, протестированному в небольших группах, с чувствительностью аппарата и условиями окружающей среды, оптимизированными для высокой стабильности. Количество O2, потребляемое мухами дикого типа в этом аппарате, соответствует тому, которое было измерено в предыдущих исследованиях. Массовое потреблениеO2 мутантами CASK, которые меньше по размеру и, как известно, менее активны, не отличалось от конгенной контрольной группы. Тем не менее, небольшой размер мутантов CASK привел к значительному снижению потребленияO2 в расчете на муху. Таким образом, микрореспирометр способен измерять потреблениеО2 у D. melanogaster, может различать скромные различия между генотипами и добавляет универсальный инструмент для измерения скорости метаболизма.
Introduction
Способность измерять скорость метаболизма имеет решающее значение для полного понимания организма в его экологическом контексте. Например, необходимо измерить скорость метаболизма, чтобы понять ее роль в продолжительности жизни1, роль диеты в метаболизме2 или порог гипоксического стресса3.
Существует два основных подхода к измерению скорости метаболизма4. Прямая калориметрия измеряет расход энергии напрямую, измеряя выработку тепла. Косвенная калориметрия измеряет выработку энергии другими способами, часто с помощью респирометрического измерения потребления O2 (VO2), производстваCO2 или и того, и другого. Несмотря на то, что прямая калориметрия применяется к мелким эктотермам, включая Drosophila melanogaster5, респирометрия технически проще и чаще используется.
Несколько форм респирометрии были успешно использованы для измерения скорости метаболизма у дикого и мутантного D. melanogaster и дали представление о метаболических эффектах температуры6, социальной среды 3, диеты 3,7 и нарушений развития нервной системы8. Они делятся на два класса, которые значительно различаются по стоимости и сложности. Манометрия – это самый простой и наименее дорогой метод 9,10, при котором мухи помещаются в герметичную камеру, содержащую абсорбентСО2 и соединенную через тонкий капилляр с резервуаром для жидкости. По мере того, как О2 расходуется, аСО2 абсорбируется, давление в камере уменьшается, и жидкость втягивается в капилляр. Таким образом, заполненный жидкостью объем капилляра пропорционален VO2. Более сложные версии, которые компенсируют силу, действующую на жидкость в капилляре, также были использованы на D. melanogaster1. Преимущества манометрии заключаются в том, что она проста и недорога, но, поскольку она чувствительна к давлению, требует постоянных условий окружающей среды. Далее, поскольку израсходованный О2 не восполняется, парциальное давление О2 (РО2) внутри камер постепенно уменьшается.
Респирометрия с использованием газового анализа также регулярно применяется для D. melanogaster. В этом случае пробы газов отбирают через равные промежутки времени из герметичных камер, содержащих мух, и направляют на инфракрасный анализатор 2,6,11. Преимущества этого типа приборов заключаются в том, что они доступны в продаже, менее чувствительны к условиям окружающей среды, а газы обновляются во время отбора проб, чтобы PO2 оставался стабильным. Однако оборудование может быть дорогим и сложным в эксплуатации.
Недавно разработанный кулонометрический микрореспирометр12 представляет собой недорогую, чувствительную и стабильную альтернативу существующим системам. На практике организм помещается в герметичную камеру, где он потребляет O2, а выдыхаемыйCO2 удаляется абсорбирующим материалом, что приводит к чистому снижению давления в камере. Когда внутреннее давление снижается до заданного порога (ON-threshold), ток пропускается через электролитический генераторO2, возвращая давление ко второму порогу (OFF-threshold), останавливая электролиз. Перенос заряда через генератор О2 прямо пропорционален количеству О2, необходимому для повышения давления в камере, и поэтому может быть использован для измерения О2, потребляемого организмом4. Метод высокочувствителен, точно измеряет V O2, а регулярная заменаO2 может поддерживать PO2 на почти постоянном уровне в течение нескольких часов или дней.
В кулонометрическом микрореспирометре, используемом в данном исследовании, используется мультимодальный (давление, температура и влажность) электронный датчик. Датчик управляется микроконтроллером, который обнаруживает небольшие изменения давления и активирует генерацию O2 при достижении низкого порога давления12. Этот аппарат собран из готовых деталей, может использоваться с широким спектром камер и экспериментальных сред и успешно применяется для изучения влияния массы тела и температуры на жука Tenebrio molitor. В настоящем исследовании микрореспирометр был адаптирован для измерения потребленияO2 у D. melanogaster, который имеет примерно 1% массы T. molitor. Чувствительность аппарата была повышена за счет снижения порога активации генерацииO2, а стабильность окружающей среды была повышена за счет проведения экспериментов в водяной бане с регулируемой температурой и поддержания влажности внутри камер на уровне или близком к 100%.
Белок CASK (кальмодулин-зависимая серинкиназа), входящий в семейство мембраноассоциированных гуанилаткиназ (MAGUK), является молекулярным каркасом в различных мультибелковых комплексах, а мутации в CASK связаны с нарушениями развития нервной системы у человека и у D. melanogaster13,14. Жизнеспособный мутант D. melanogaster, CASKΔ18, нарушает активность дофаминергических нейронов 15 и снижает уровень активности более чем на 50% по сравнению с конгенной контрольной группой14,16. Из-за пониженных уровней активности мутантов CASK и роли катехоламинов в регуляции метаболизма17 мы предположили, что их стандартная скорость метаболизма и, следовательно, потреблениеO2 будут значительно снижены по сравнению с контрольной группой.
ПотреблениеO2 измеряли в CASKΔ18 и их конгенерах дикого типа, w(ex33). Группы мух помещали в респирометрические камеры, измеряли расход О2, рассчитывали и выражали расходО2 как по массе, так и по мухе. Аппарат зарегистрировал VO2 у мух дикого типа, что согласуется с предыдущими исследованиями, и он смог дифференцировать потребление O2 мухами дикого типа и мухами-мутантами CASK на муху.
Protocol
Representative Results
Discussion
Приведенная выше методика демонстрирует измерение потребленияО2 у D. Melanogaster с помощью электронного кулонометрического микрореспирометра. Полученные данные о потребленииО2 у D. melanogaster дикого типа находились в пределах диапазонов, описанных в большинстве предыдущи…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Линду Рестифо из Университета Аризоны за предложение провести тестирование потребления O2 мутантами CASK и за отправку мутантов CASK и их конгенных контрольных групп. Плата за публикацию была предоставлена Департаментским фондом реинвестирования биологического факультета Университета Колледж-Парка. Помещение и некоторое оборудование были предоставлены университетами в Шейди-Гроув.
Materials
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
Referências
- Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
- Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H. Dietary nutrient balance shapes phenotypic traits of Drosophila melanogaster in interaction with gut microbiota. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 241, 110626 (2020).
- Burggren, W., Souder, B. M., Ho, D. H. Metabolic rate and hypoxia tolerance are affected by group interactions and sex in the fruit fly (Drosophila melanogaster): new data and a literature survey. Biology Open. 6, 471-480 (2017).
- Lighton, J. R. B. . Measuring Metabolic Rates. , (2019).
- Fiorino, A., et al. Parallelized, real-time, metabolic-rate measurements from individual Drosophila. Scientific Reports. 8 (1), 14452 (2018).
- Berrigan, D., Partridge, L. Influence of temperature and activity on the rate of adult Drosophila melanogaster. Comparative Biochemistry and Physiology. 118 (4), 1301-1307 (1997).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Botero, V., et al. Neurofibromin regulates metabolic rate via neuronal mechanisms in Drosophila. Nature Communications. 12 (1), 4285 (2021).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry. Journal of Visualized Experiments. (88), 51681 (2014).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46 (11), 1477-1480 (2000).
- Brown, E. B., Klok, J., Keene, A. C. Measuring metabolic rate in single flies during sleep and waking states via indirect calorimetry. Journal of Neuroscience Methods. 376, 109606 (2022).
- Sandstrom, D. J., Offord, B. W. Measurement of oxygen consumption in Tenebrio molitor using a sensitive, inexpensive, sensor-based coulometric microrespirometer. Journal of Experimental Biology. 225 (9), jeb243966 (2022).
- Becker, M., et al. Presynaptic dysfunction in CASK-related neurodevelopmental disorders. Translational Psychiatry. 10 (1), 312 (2020).
- Slawson, J. B., et al. Central Regulation of Locomotor Behavior of Drosophila melanogaster Depends on a CASK Isoform Containing CaMK-Like and L27 Domains. Genética. 187 (1), 171-184 (2011).
- Slawson, J. B., et al. Regulation of dopamine release by CASK-Î2 modulates locomotor initiation in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. Journal of Neurogenetics. 35 (1), 1-22 (2021).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine Modulates Metabolic Rate and Temperature Sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7 (2), e31513 (2012).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Lack of correlation between body mass and metabolic rate in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 50 (5), 445-453 (2004).
- Norton, F. J. Permeation of gases through solids. Journal of Applied Physics. 28 (1), 34-39 (1957).
- Hoegh-Guldberg, O., Manahan, D. T. Coulometric measurement of oxygen-consumption during development of marine invertebrate embryos and larvae. Journal of Experimental Biology. 198 (1), 19-30 (1995).
- Sohal, R. S., Agarwal, A., Agarwal, S., Orr, W. C. Simultaneous overexpression of copper- and zinc-containing superoxide dismutase and catalase retards age-related oxidative damage and increases metabolic potential in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Chemistry. 270 (26), 15671-15674 (1995).
- Van Voorhies, W. A., Melvin, R. G., Ballard, J. W. O., Williams, J. B. Validation of manometric microrespirometers for measuring oxygen consumption in small arthropods. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1132-1137 (2008).
- Herreid, C. F., Full, R. J. Cockroaches on a treadmill: Aerobic running. Journal of Insect Physiology. 30 (5), 395-403 (1984).
