Genetische profilering en drop-outscreening op genoomschaal om therapeutische doelen te identificeren in muismodellen van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren
Summary
We hebben een soortoverschrijdende vergelijkende oncogenomics-benadering ontwikkeld met behulp van genomische analyses en functionele genomische screenings om therapeutische doelen te identificeren en te vergelijken in tumoren die ontstaan in genetisch gemanipuleerde muismodellen en het overeenkomstige menselijke tumortype.
Abstract
Maligne perifere zenuwschedetumoren (MPNST’s) zijn afgeleid van Schwann-cellen of hun voorlopers. Bij patiënten met het tumorgevoeligheidssyndroom neurofibromatose type 1 (NF1) zijn MPNST’s de meest voorkomende maligniteit en de belangrijkste doodsoorzaak. Deze zeldzame en agressieve wekedelensarcomen bieden een grimmige toekomst, met 5-jaars ziektevrije overlevingspercentages van 34-60%. Behandelingsopties voor personen met MPNST’s zijn teleurstellend beperkt, waarbij ontsierende chirurgie de belangrijkste behandelingsoptie is. Veel ooit veelbelovende therapieën zoals tipifarnib, een remmer van Ras-signalering, hebben klinisch gefaald. Evenzo hebben fase II klinische onderzoeken met erlotinib, dat zich richt op de epidermale groeifactor (EFGR), en sorafenib, dat zich richt op de vasculaire endotheliale groeifactorreceptor (VEGF), van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor (PDGF) en Raf, in combinatie met standaard chemotherapie, ook geen respons opgeleverd bij patiënten.
In de afgelopen jaren zijn functionele genomische screeningsmethoden in combinatie met genetische profilering van kankercellijnen nuttig gebleken voor het identificeren van essentiële cytoplasmatische signaleringsroutes en de ontwikkeling van doelspecifieke therapieën. In het geval van zeldzame tumortypes wordt een variatie op deze benadering, bekend als cross-species comparative oncogenomics, steeds vaker gebruikt om nieuwe therapeutische doelen te identificeren. In cross-species vergelijkende oncogenomica worden genetische profilering en functionele genomica uitgevoerd in genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEM) en de resultaten worden vervolgens gevalideerd in de zeldzame menselijke specimens en cellijnen die beschikbaar zijn.
Dit artikel beschrijft hoe kandidaat-drivergenmutaties in MPNST-cellen van mensen en muizen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van whole exome sequencing (WES). Vervolgens beschrijven we hoe shRNA-screenings op genoomschaal kunnen worden uitgevoerd om kritieke signaalroutes in muizen en menselijke MPNST-cellen te identificeren en te vergelijken en geneeskrachtige doelen in deze routes te identificeren. Deze methodologieën bieden een effectieve benadering voor het identificeren van nieuwe therapeutische doelen in een verscheidenheid aan soorten kanker bij de mens.
Introduction
Maligne perifere zenuwschedetumoren (MPNST’s) zijn zeer agressieve spindelcelneoplasmata die ontstaan in verband met het tumorgevoeligheidssyndroom neurofibromatose type 1 (NF1), sporadisch in de algemene bevolking en op plaatsen van eerdere radiotherapie 1,2,3. NF1-patiënten worden geboren met een wild-type kopie van het NF1-tumorsuppressorgen en een tweede NF1-allel met een mutatie met functieverlies. Deze toestand van haplo-insufficiëntie maakt NF1-patiënten vatbaar voor een tweede mutatie met functieverlies in hun wildtype NF1-gen, dat tumorigenese veroorzaakt. Wanneer deze “second hit” NF1-mutatie optreedt in een cel in de Schwann-cellijn, is de resulterende tumor ofwel een dermaal neurofibroom dat in de huid ontstaat of een plexiform neurofibroom dat zich ontwikkelt in grote zenuwen of zenuwplexussen. Hoewel de pathologie van dermale en plexiforme neurofibromen identiek is, is hun biologische gedrag heel anders – hoewel zowel dermale als plexiforme neurofibromen goedaardig zijn, kunnen alleen plexiforme neurofibromen transformatie ondergaan en aanleiding geven tot MPNST’s. Naast het verlies van neurofibromine, het Ras GTPase-activerende eiwit dat wordt gecodeerd door het NF1-gen, dragen MPNST’s mutaties van meerdere andere tumorsuppressorgenen, waaronder TP53 4,5,6,7, CDKN2A 8,9 pt PTEN 10, mutaties van genen die coderen voor componenten van polycomb repressief complex 2 11,12 (PRC2; de SUZ12– en EED-genen) en afwijkende expressie van receptortyrosinekinasen 1,2. Mutaties van NF1 en de andere hierboven vermelde genen zijn ook aanwezig in sporadische en door straling geïnduceerde MPNST’s11,12.
Hoewel deze vooruitgang in ons begrip van de genomische afwijkingen in MPNST’s van onschatbare waarde is geweest voor het begrijpen van hun pathogenese, hebben ze nog niet geleid tot de ontwikkeling van effectieve nieuwe therapieën voor MPNST’s. Een belangrijke barrière die de ontwikkeling van nieuwe behandelingen belemmert, is het feit dat MPNST’s zeldzame vormen van kanker zijn. Hierdoor is het moeilijk om het grote aantal patiëntenmonsters te verkrijgen dat nodig is voor wereldwijde analyses die belangrijke drivermutaties definiëren, zoals die van The Cancer Genome Atlas (TCGA). Onze ervaring is dat het jaren kan duren om zelfs maar een bescheiden aantal menselijke MPNST-exemplaren te verzamelen. Om dergelijke beperkingen te overwinnen, hebben veel onderzoekers die andere zeldzame kankertypes bestuderen, zich gewend tot het gebruik van vergelijkende oncogenomica tussen soorten om essentiële driver-genmutaties te identificeren, de essentiële cytoplasmatische signaleringsroutes in hun tumor van belang te definiëren en nieuwe therapeutische doelen te identificeren. Aangezien de signaalroutes die essentieel zijn voor het ontstaan van tumoren sterk geconserveerd zijn tussen mensen en andere gewervelde soorten, kan het toepassen van functionele genomics-benaderingen zoals shRNA-schermen op genoomschaal een effectief middel zijn om deze nieuwe drivermutaties, signaalroutes en therapeutische doelen te identificeren 13,14,15,16,17,18,19, met name bij het bestuderen van zeldzame menselijke tumortypes die beschikbaar zijn in beperkende aantallen20.
In de hier gepresenteerde methodologieën beschrijven we deze benadering voor het uitvoeren van genomische profilering in menselijke MPNST-cellijnen en vroege passage MPNST-culturen afgeleid van P 0-GGFβ3-muizen, een genetisch gemanipuleerd muismodel (GEM) waarin Schwann-celspecifieke overexpressie van de groeifactor neureguline-1 (NRG1) de pathogenese van plexiforme neurofibromen en hun daaropvolgende progressie naar MPNST’sbevordert. 22,23. De eerste stap in deze aanpak is het identificeren van kandidaat-drivergenen in P 0-GGFβ3 MPNST’s, menselijke MPNST-cellijnen en chirurgisch verwijderde menselijke MPNST’s. Om de signaalroutes die door deze mutaties worden beïnvloed functioneel te valideren, gebruiken we vervolgens shRNA-schermen op genoomschaal om de genen te identificeren die nodig zijn voor proliferatie en overleving in MPNST-cellijnen van mensen en muizen. Na het identificeren van de genen die nodig zijn voor proliferatie en overleving, identificeren we vervolgens de geneeskrachtige genproducten binnen de verzameling “hits” met behulp van de Drug Gene Interaction Database. We vergelijken ook de “hits” in MPNST-cellen van mensen en muizen, om te bepalen of het GEM-model en menselijke MPNST’s een vergelijkbare afhankelijkheid van dezelfde genen en signaalroutes vertonen. Het identificeren van overlappingen in de genen die nodig zijn voor proliferatie en overleving en de aangetaste signaalroutes dient als een middel om het P 0-GGFβ3-muismodel op moleculair niveau te valideren. Deze benadering benadrukt ook de effectiviteit van het combineren van menselijke en muisschermen om nieuwe therapeutische doelen te identificeren, waarbij het muismodel kan dienen als aanvulling op de menselijke schermen. De waarde van deze soortoverschrijdende benadering is vooral duidelijk bij het zoeken naar therapeutische doelwitten in zeldzame tumoren, waar menselijke tumoren en cellijnen moeilijk te verkrijgen zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
De gedetailleerde methoden die hier worden gepresenteerd, zijn ontwikkeld om neoplasie van het perifere zenuwstelsel en MPNST-pathogenese te bestuderen. Hoewel we hebben vastgesteld dat deze methoden effectief zijn, moet worden erkend dat er enkele potentiële beperkingen zijn aan de methoden die we hier beschrijven. Hieronder bespreken we enkele van die beperkingen en mogelijke strategieën om ze in andere modelsystemen te overwinnen.
We hebben ontdekt dat sequencing van het hele exoom effect…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 en R01 NS109655 aan S.L.C.; R01 NS109655-03S1 aan D.P.J.), het National Cancer Institute (R01 CA122804 aan S.L.C.), en het Ministerie van Defensie (X81XWH-09-1-0086 en W81XWH-12-1-0164 aan S.L.C.).
Materials
| Bioruptor Sonication System | Diagenode | UCD-600 | |
| CASAVA 1.8.2 | |||
| Cbot | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software | |||
| Citrisolve Hybrid | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Corning 96-well Black Microplate | Millipore Sigma | CLS3603 | |
| Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes | Diagenode | C30010009 | |
| dNTP mix | Clontech | 639210 | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Elution buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’ | |||
| FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’ | |||
| GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’ | HPLC purified | ||
| GraphPad Prism | Dotmatics | ||
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Illumina HiScanSQ | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| PLUS Transfection Reagent | Thermo Scientific | 11514015 | |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR1003G | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Qiagen Buffer P1 | Qiagen | 19051 | |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’ | |||
| RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’ | |||
| Titanium Taq polymerase | Clontech | 639210 | |
| Trimmomatic software | www.usadellab.org |
Referências
- Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).
- Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent Advances in the Diagnosis and Pathogenesis of Neurofibromatosis Type 1 (NF1)-associated Peripheral Nervous System Neoplasms. Adv Anat Pathol. 25 (5), 353-368 (2018).
- Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Adv Cancer Res. 153, 305-341 (2022).
- Birindelli, S., et al. Rb and TP53 pathway alterations in sporadic and NF1-related malignant peripheral nerve sheath tumors. Lab Invest. 81 (6), 833-844 (2001).
- Legius, E., et al. TP53 mutations are frequent in malignant NF1 tumors. Genes Chromosomes Cancer. 10 (4), 250-255 (1994).
- Menon, A. G., et al. Chromosome 17p deletions and p53 gene mutations associated with the formation of malignant neurofibrosarcomas in von Recklinghausen neurofibromatosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (14), 5435-5439 (1990).
- Upadhyaya, M., et al. Germline and somatic NF1 gene mutation spectrum in NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs). Hum Mutat. 29 (1), 74-82 (2008).
- Kourea, H. P., Orlow, I., Scheithauer, B. W., Cordon-Cardo, C., Woodruff, J. M. Deletions of the INK4A gene occur in malignant peripheral nerve sheath tumors but not in neurofibromas. Am J Pathol. 155 (6), 1855-1860 (1999).
- Nielsen, G. P., et al. Malignant transformation of neurofibromas in neurofibromatosis 1 is associated with CDKN2A/p16 inactivation. Am J Pathol. 155 (6), 1879-1884 (1999).
- Gregorian, C., et al. PTEN dosage is essential for neurofibroma development and malignant transformation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (46), 19479-19484 (2009).
- Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1227-1232 (2014).
- Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1170-1172 (2014).
- Varela, I., et al. Somatic structural rearrangements in genetically engineered mouse mammary tumors. Genome Biol. 11 (10), 100 (2010).
- Johnson, R. A., et al. Cross-species genomics matches driver mutations and cell compartments to model ependymoma. Nature. 466 (7306), 632-636 (2010).
- Kim, M., et al. Comparative oncogenomics identifies NEDD9 as a melanoma metastasis gene. Cell. 125 (7), 1269-1281 (2006).
- Zender, L., et al. Identification and validation of oncogenes in liver cancer using an integrative oncogenomic approach. Cell. 125 (7), 1253-1267 (2006).
- Uren, A. G., et al. Large-scale mutagenesis in p19(ARF)- and p53-deficient mice identifies cancer genes and their collaborative networks. Cell. 133 (4), 727-741 (2008).
- Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323 (5922), 1747-1750 (2009).
- Dupuy, A. J., et al. A modified sleeping beauty transposon system that can be used to model a wide variety of human cancers in mice. Cancer Res. 69 (20), 8150-8156 (2009).
- Carroll, S. L. The Challenge of Cancer Genomics in Rare Nervous System Neoplasms: Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors as a Paradigm for Cross-Species Comparative Oncogenomics. Am J Pathol. 186 (3), 464-477 (2016).
- Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. J Neurosci. 23 (19), 7269-7280 (2003).
- Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. Am J Pathol. 182 (3), 646-667 (2013).
- Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathol. 127 (4), 573-591 (2014).
- Hart, T., Brown, K. R., Sircoulomb, F., Rottapel, R., Moffat, J. Measuring error rates in genomic perturbation screens: gold standards for human functional genomics. Mol Syst Biol. 10 (7), 733 (2014).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens. G3. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Sci Rep. 11 (1), 5690 (2021).
- Maser, R. S., et al. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447 (7147), 966-971 (2007).
- Rahrmann, E. P., et al. Forward genetic screen for malignant peripheral nerve sheath tumor formation identifies new genes and pathways driving tumorigenesis. Nat Genet. 45 (7), 756-766 (2013).
