악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 치료 표적을 식별하기 위한 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 드롭아웃 스크리닝
Summary
우리는 유전자 조작 마우스 모델에서 발생하는 종양과 해당 인간 종양 유형에서 발생하는 종양의 치료 표적을 식별하고 비교하기 위해 게놈 분석 및 기능적 게놈 스크리닝을 활용하는 종간 비교 종양유전체학 접근 방식을 개발했습니다.
Abstract
악성 말초 신경초 종양(MPNST)은 슈반(Schwann) 세포 또는 그 전구체에서 유래합니다. 종양 감수성 증후군 신경섬유종증 1형(NF1) 환자에서 MPNST는 가장 흔한 악성 종양이자 주요 사망 원인입니다. 이 희귀하고 공격적인 연조직 육종은 5년 무병 생존율이 34-60%에 달하는 암울한 미래를 제시합니다. MPNST 환자를 위한 치료 옵션은 실망스러울 정도로 제한적이며, 변형 수술이 가장 중요한 치료 옵션입니다. Ras 신호전달 억제제인 티피파르닙(tipifarnib)과 같이 한때 유망했던 많은 치료법이 임상적으로 실패했다. 마찬가지로, 표피 성장 인자(EFGR)를 표적으로 하는 엘로티닙과 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGF), 혈소판 유래 성장 인자 수용체(PDGF)를 표적으로 하는 소라페닙, 그리고 Raf를 표준 화학요법과 병용하는 임상 2상 시험에서도 환자에게 반응을 보이지 못했습니다.
최근 몇 년 동안 암 세포주의 유전자 프로파일링과 결합된 기능적 게놈 스크리닝 방법은 필수 세포질 신호 전달 경로를 식별하고 표적 특이적 치료법을 개발하는 데 유용한 것으로 입증되었습니다. 희귀 종양 유형의 경우, 종간 비교 종양유전체학(cross-species comparative oncogenomics)으로 알려진 이 접근법의 변형이 새로운 치료 표적을 식별하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 종간 비교 종양유전체학에서 유전자 프로파일링 및 기능적 유전체학은 유전자 조작 마우스(GEM) 모델에서 수행되며 결과는 사용 가능한 희귀 인간 표본 및 세포주에서 검증됩니다.
본 논문은 전체 엑솜 염기서열분석(whole exome sequencing, WES)을 이용하여 인간 및 마우스 MPNST 세포에서 후보 드라이버 유전자 돌연변이를 식별하는 방법을 설명합니다. 그런 다음 게놈 스케일 shRNA 스크리닝을 수행하여 마우스 및 인간 MPNST 세포에서 중요한 신호 전달 경로를 식별 및 비교하고 이러한 경로에서 약물 가능한 표적을 식별하는 방법을 설명합니다. 이러한 방법론은 다양한 인간 암 유형에서 새로운 치료 표적을 식별하는 효과적인 접근 방식을 제공합니다.
Introduction
악성 말초신경초종양(MPNST)은 종양감수성 증후군인 신경섬유종증 1형(NF1)과 관련하여 발생하는 매우 공격적인 방추세포 신생물로, 일반 인구 집단과 이전 방사선 치료 부위에서 산발적으로 발생합니다 1,2,3. NF1 환자는 NF1 종양 억제 유전자의 야생형 사본과 기능 상실 돌연변이가 있는 두 번째 NF1 대립유전자 를 가지고 태어납니다. 이러한 하플로인기능부전(haploinsufficiency) 상태는 NF1 환자를 야생형 NF1 유전자의 두 번째 기능 상실 돌연변이에 취약하게 만들어 종양형성을 유발합니다. 이 “두 번째 히트” NF1 돌연변이가 슈반(Schwann) 세포 계통의 세포에서 발생하면, 그 결과로 생기는 종양은 피부에서 발생하는 진피 신경섬유종이거나 큰 신경 또는 신경총에서 발생하는 망상형 신경섬유종입니다. 진피 신경섬유종과 망상형 신경섬유종의 병리학은 동일하지만, 생물학적 거동은 상당히 다릅니다 – 진피와 망상신경섬유종은 모두 양성이지만, 망상신경섬유종만이 변형을 겪을 수 있고 MPNST를 일으킬 수 있습니다. NF1 유전자에 의해 암호화된 Ras GTPase 활성화 단백질인 뉴로피브롬의 손실 외에도, MPNST는 TP53 4,5,6,7, CDKN2A 8,9 및 PTEN 10을 포함한 여러 다른 종양 억제 유전자의 돌연변이, 폴리콤 억제 복합체 2 11,12 의 구성 요소를 암호화하는 유전자의 돌연변이(PRC2; SUZ12 및 EED 유전자) 및 수용체 티로신 키나아제 1,2의 비정상적인 발현. NF1 및 상술한 다른 유전자들의 돌연변이는 산발적이고 방사선에 의해 유도된 MPNST에서도 존재한다11,12.
MPNST의 게놈 이상에 대한 이해의 이러한 발전은 발병 기전을 이해하는 데 매우 중요하지만 MPNST에 대한 효과적인 새로운 치료법의 개발로 이어지지는 않았습니다. 새로운 치료법의 개발을 방해하는 주요 장벽은 MPNST가 희귀 암이라는 사실입니다. 이 때문에 TCGA(The Cancer Genome Atlas)에서 수행한 것과 같은 주요 동인 돌연변이를 정의하는 글로벌 분석에 필요한 많은 수의 환자 샘플을 얻기가 어렵습니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 적당한 수의 인간 MPNST 표본을 축적하는 데에도 몇 년이 걸릴 수 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 다른 희귀 암 유형을 연구하는 많은 연구자들은 필수 드라이버 유전자 돌연변이를 식별하고, 관심 종양에서 필수 세포질 신호 전달 경로를 정의하고, 새로운 치료 표적을 식별하기 위해 종 간 비교 종양유전체학을 사용하고 있습니다. 종양형성에 필수적인 신호전달 경로는 인간과 다른 척추동물 종 사이에서 매우 잘 보존되어 있기 때문에 게놈 스케일 shRNA 스크리닝과 같은 기능적 유전체학 접근법을 적용하는 것은 이러한 새로운 드라이버 돌연변이, 신호전달 경로 및 치료 표적을 식별하는 효과적인 수단이 될 수 있습니다 13,14,15,16,17,18,19, 특히 제한된 수로 사용할 수 있는 희귀 인간 종양 유형을 연구할 때20개.
여기에 제시된 방법론에서는 성장 인자 뉴레굴린-1(NRG1)의 슈반(Schwann) 세포 특이적 과발현이 망상형 신경섬유종의 발병 기전과 MPNST로의 후속 진행을 촉진하는 유전자 조작 마우스 모델(GEM)인 P 0-GGFβ3 마우스에서 유래한 인간 MPNST 세포주 및 초기 통과 MPNST 배양에서 게놈 프로파일링을 수행하는 이러한 접근 방식을 설명합니다21, 22,23. 이 접근법의 첫 번째 단계는 P 0-GGFβ3 MPNST, 인간 MPNST 세포주 및 외과적으로 절제된 인간 MPNST에서 후보 드라이버 유전자를 식별하는 것입니다. 이러한 돌연변이의 영향을 받는 신호 전달 경로를 기능적으로 검증하기 위해 게놈 스케일 shRNA 스크리닝을 사용하여 인간 및 마우스 MPNST 세포주에서 증식과 생존에 필요한 유전자를 식별합니다. 증식과 생존에 필요한 유전자를 확인한 후, 약물 유전자 상호작용 데이터베이스(Drug Gene Interaction Database)를 사용하여 “히트(hit)” 컬렉션 내에서 약물 가능한 유전자 산물을 식별합니다. 또한 GEM 모델과 인간 MPNST가 동일한 유전자 및 신호 전달 경로에 대해 유사한 의존성을 보이는지 여부를 결정하기 위해 인간 및 마우스 MPNST 세포의 “적중”을 비교합니다. 증식 및 생존에 필요한 유전자와 영향을 받는 신호 전달 경로의 중복을 식별하는 것은 분자 수준에서 P 0-GGFβ3 마우스 모델을 검증하는 수단이 됩니다. 이 접근법은 또한 인간 스크리닝을 보완하는 역할을 할 수 있는 새로운 치료 표적을 식별하기 위해 인간과 마우스 스크리닝을 결합하는 효과를 강조합니다. 이러한 종간 접근법의 가치는 인간 종양과 세포주를 얻기 어려운 희귀 종양에서 치료 표적을 찾을 때 특히 분명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 자세한 방법은 말초 신경계 종양 및 MPNST 발병 기전을 연구하기 위해 개발되었습니다. 이러한 방법이 효과적인 것으로 확인되었지만 여기에서 설명하는 방법에는 몇 가지 잠재적인 제한 사항이 있음을 인식해야 합니다. 아래에서는 이러한 한계 중 일부와 다른 모델 시스템에서 이를 극복하기 위한 잠재적 전략에 대해 설명합니다.
전체 엑솜 염기서열분석이 P 0-…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소(R01 NS048353 및 R01 NS109655 SLC의 보조금으로 지원되었습니다. R01 NS109655-03S1 – D.P.J.), 국립 암 연구소(R01 CA122804 – S.L.C.), 국방부(X81XWH-09-1-0086 및 W81XWH-12-1-0164 – S.L.C.).
Materials
| Bioruptor Sonication System | Diagenode | UCD-600 | |
| CASAVA 1.8.2 | |||
| Cbot | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software | |||
| Citrisolve Hybrid | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Corning 96-well Black Microplate | Millipore Sigma | CLS3603 | |
| Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes | Diagenode | C30010009 | |
| dNTP mix | Clontech | 639210 | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Elution buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’ | |||
| FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’ | |||
| GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’ | HPLC purified | ||
| GraphPad Prism | Dotmatics | ||
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Illumina HiScanSQ | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| PLUS Transfection Reagent | Thermo Scientific | 11514015 | |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR1003G | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Qiagen Buffer P1 | Qiagen | 19051 | |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’ | |||
| RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’ | |||
| Titanium Taq polymerase | Clontech | 639210 | |
| Trimmomatic software | www.usadellab.org |
Referências
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