Perfil Genético e Triagem de Abandono em Escala Genômica para Identificar Alvos Terapêuticos em Modelos Murinos de Tumor Maligno de Bainha de Nervo Periférico

Summary

Desenvolvemos uma abordagem oncogenômica comparativa entre espécies utilizando análises genômicas e telas genômicas funcionais para identificar e comparar alvos terapêuticos em tumores surgidos em modelos de camundongos geneticamente modificados e o tipo de tumor humano correspondente.

Abstract

Os Tumores Malignos de Bainha de Nervo Periférico (MPNSTs) são derivados das células de Schwann ou de seus precursores. Em pacientes com a síndrome de suscetibilidade tumoral neurofibromatose tipo 1 (NF1), os MPNSTs são a neoplasia maligna mais comum e a principal causa de morte. Esses sarcomas de partes moles raros e agressivos oferecem um futuro promissor, com taxas de sobrevida livre de doença em 5 anos de 34-60%. As opções de tratamento para indivíduos com MPNSTs são decepcionantemente limitadas, sendo a cirurgia desfigurante a principal opção de tratamento. Muitas terapias outrora promissoras, como o tipifarnibe, um inibidor da sinalização de Ras, falharam clinicamente. Da mesma forma, ensaios clínicos de fase II com erlotinib, que tem como alvo o fator de crescimento epidérmico (EFGR), e sorafenib, que tem como alvo o receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), o receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e o Raf, em combinação com a quimioterapia padrão, também falharam em produzir resposta nos pacientes.

Nos últimos anos, métodos de triagem genômica funcional combinados com o perfil genético de linhagens de células cancerosas têm se mostrado úteis para a identificação de vias essenciais de sinalização citoplasmática e o desenvolvimento de terapias alvo-específicas. No caso de tipos raros de tumores, uma variação dessa abordagem conhecida como oncogenômica comparativa entre espécies está sendo cada vez mais usada para identificar novos alvos terapêuticos. Na oncogenômica comparativa entre espécies, o perfil genético e a genômica funcional são realizados em modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) e os resultados são validados em espécimes humanos raros e linhagens celulares disponíveis.

Este artigo descreve como identificar mutações no gene driver candidato em células MPNST humanas e de camundongos usando o sequenciamento completo do exoma (WES). Em seguida, descrevemos como realizar telas de shRNA em escala genômica para identificar e comparar vias críticas de sinalização em células MPNST humanas e de camundongos e identificar alvos farmacológicos nessas vias. Essas metodologias fornecem uma abordagem eficaz para identificar novos alvos terapêuticos em uma variedade de tipos de câncer humano.

Introduction

Os tumores malignos da bainha dos nervos periféricos (MPNSTs) são neoplasias de células fusiformes altamente agressivas que surgem em associação com a síndrome de suscetibilidade tumoral neurofibromatose tipo 1 (NF1), esporadicamente na população geral e em locais de radioterapia ^prévia1,2,3. Os pacientes com NF1 nascem com uma cópia selvagem do gene supressor de tumor NF1 e um segundo alelo NF1 com uma mutação de perda de função. Esse estado de haploinsuficiência torna os pacientes com NF1 suscetíveis a uma segunda mutação de perda de função em seu gene NF1 selvagem, que desencadeia a tumorigênese. Quando essa mutação NF1 de “segundo impacto” ocorre em uma célula da linhagem celular de Schwann, o tumor resultante é um neurofibroma dérmico que surge na pele ou um neurofibroma plexiforme que se desenvolve em grandes nervos ou plexos nervosos. Embora a patologia dos neurofibromas dérmicos e plexiformes seja idêntica, seu comportamento biológico é bastante diferente – embora os neurofibromas dérmicos e plexiformes sejam benignos, apenas os neurofibromas plexiformes podem sofrer transformação e dar origem aos MPNSTs. Além da perda de neurofibromina, a proteína ativadora da GTPase Ras codificada pelo gene NF1, as MPNSTs carregam mutações de vários outros genes supressores de tumor, incluindo TP53 4,5,6,7, CDKN2A ^8,9 e PTEN 10, mutações de genes que codificam componentes do complexo repressivo policomb 2 11,12 (PRC2; o genes SUZ12 e EED) e expressão aberrante do receptor tirosina quinases ^1,2. Mutações da NF1 e dos demais genes citados acima também estão presentes em MPNSTs esporádicas e induzidas por radiação^11,12.

Embora esses avanços em nossa compreensão das anormalidades genômicas em MPNSTs tenham sido inestimáveis para a compreensão de sua patogênese, eles ainda não resultaram no desenvolvimento de novas terapias eficazes para MPNSTs. Uma grande barreira que impede o desenvolvimento de novos tratamentos é o fato de que os MPNSTs são cânceres raros. Devido a isso, é difícil obter o grande número de amostras de pacientes que são necessárias para análises globais que definem mutações chave como as realizadas pelo Atlas do Genoma do Câncer (TCGA). Em nossa experiência, acumular até mesmo um número modesto de espécimes humanos de MPNST pode levar anos. Para superar tais limitações, muitos pesquisadores que estudam outros tipos raros de câncer têm se voltado para o uso de oncogenômica comparativa entre espécies para identificar mutações genéticas condutoras essenciais, definir as vias de sinalização citoplasmáticas essenciais em seu tumor de interesse e identificar novos alvos terapêuticos. Uma vez que as vias de sinalização essenciais para a tumorigênese são altamente conservadas entre humanos e outras espécies de vertebrados, a aplicação de abordagens genômicas funcionais, como telas de shRNA em escala genômica, pode ser um meio eficaz de identificar essas novas mutações condutoras, vias de sinalização e alvos terapêuticos 13,14,15,16,17,18,19 , particularmente quando se estudam tipos raros de tumores humanos que estão disponíveis em números limitantes²⁰.

Nas metodologias aqui apresentadas, descrevemos essa abordagem para realizar o perfil genômico em linhagens celulares humanas de MPNST e culturas de MPNST de passagem precoce derivadas de camundongos P 0-GGFβ3, um modelo de camundongo geneticamente modificado (GEM) no qual a superexpressão específica de células de Schwann do fator de crescimento neuregulina-1 (NRG1) promove a patogênese dos neurofibromas plexiformes e sua subsequente progressão para MPNSTs ^{21, 22,23}. O primeiro passo nesta abordagem é identificar genes condutores candidatos em MPNSTs P 0-GGFβ3, linhagens celulares MPNST humanas e MPNSTs humanas ressecadas cirurgicamente. Para validar funcionalmente as vias de sinalização afetadas por essas mutações, usamos telas de shRNA em escala genômica para identificar os genes necessários para a proliferação e sobrevivência em linhagens celulares MPNST humanas e de camundongos. Depois de identificar os genes necessários para a proliferação e sobrevivência, identificamos os produtos gênicos farmacológicos dentro da coleção de “hits” usando o Drug Gene Interaction Database. Nós também comparamos os “hits” em células MPNST humanas e de camundongos, para determinar se o modelo GEM e MPNSTs humanos demonstram dependência semelhante dos mesmos genes e vias de sinalização. A identificação de sobreposições nos genes necessários para a proliferação e sobrevivência e as vias de sinalização afetadas serve como um meio de validar o modelo de camundongo P 0-GGFβ3 em nível molecular. Essa abordagem também enfatiza a eficácia da combinação de telas humanas e de camundongos para identificar novos alvos terapêuticos, onde o modelo de camundongo pode servir como um complemento às telas humanas. O valor desta abordagem entre espécies é particularmente aparente quando se procura alvos terapêuticos em tumores raros, onde tumores humanos e linhagens celulares são difíceis de obter.

Protocol

Antes do início dos estudos, os procedimentos e protocolos em animais para manejo de vetores virais foram revisados e aprovados pela Comissão Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) e pela Comissão Institucional de Biossegurança (CIB). Os procedimentos aqui descritos foram aprovados pelos Conselhos IACUC e IBC da Universidade Médica da Carolina do Sul e foram realizados por pessoal devidamente treinado, de acordo com o NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals e as diretrizes institucionais de cuid…

Representative Results

Os gráficos da Figura 5 mostram escores de depleção de genes essenciais centrais (CEGs) rotulados como TRUE em comparação com não-CEGs (rotulados como FALSE) em cada linhagem celular humana que foi triada. Os pontos representam log2 dos escores de depleção de dobras para genes individuais, que são plotados sobre uma representação boxplot da distribuição geral do estrofe. O teste t de Student foi utilizado para testar a diferença significativa na média dos escores de d…

Discussion

Os métodos detalhados aqui apresentados foram desenvolvidos para estudar a neoplasia do sistema nervoso periférico e a patogênese do MPNST. Embora tenhamos encontrado esses métodos como eficazes, deve-se reconhecer que existem algumas limitações potenciais para os métodos que descrevemos aqui. A seguir, discutimos algumas dessas limitações e possíveis estratégias para superá-las em outros sistemas modelo.

Descobrimos que o sequenciamento completo do exoma efetivamente identifica mu…

Materials

Bioruptor Sonication System	Diagenode	UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot	Illumina, San Diego, CA	N/A
Celigo Image Cytometer	Nexcelom	N/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve Hybrid	Decon Laboratories	5989-27-5
Corning 96-well Black Microplate	Millipore Sigma	CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes	Diagenode	C30010009
dNTP mix	Clontech	639210
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Elution buffer	Qiagen	19086
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Excel	Microsoft
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’			HPLC purified
GraphPad Prism	Dotmatics
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Illumina HiScanSQ	Illumina, San Diego, CA	N/A
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
PLUS Transfection Reagent	Thermo Scientific	11514015
Polybrene Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR1003G
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Qiagen Buffer P1	Qiagen	19051
Qiagen Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymerase	Clontech	639210
Trimmomatic software		www.usadellab.org