Genetisches Profiling und Dropout-Screening im Genommaßstab zur Identifizierung therapeutischer Ziele in Mausmodellen für bösartige periphere Nervenscheidentumoren

Summary

Wir haben einen speziesübergreifenden vergleichenden Onkogenomik-Ansatz entwickelt, der genomische Analysen und funktionelle genomische Screenings verwendet, um therapeutische Ziele in Tumoren, die in gentechnisch veränderten Mausmodellen auftreten, und den entsprechenden menschlichen Tumortyp zu identifizieren und zu vergleichen.

Abstract

Maligne periphere Nervenscheidentumoren (MPNSTs) stammen von Schwann-Zellen oder ihren Vorläufern ab. Bei Patienten mit dem Tumor-Suszeptibilitäts-Syndrom Neurofibromatose Typ 1 (NF1) sind MPNSTs die häufigste Malignität und die häufigste Todesursache. Diese seltenen und aggressiven Weichteilsarkome bieten mit einer krankheitsfreien 5-Jahres-Überlebensrate von 34-60% eine düstere Zukunft. Die Behandlungsmöglichkeiten für Menschen mit MPNST sind enttäuschend begrenzt, wobei eine entstellende Operation die wichtigste Behandlungsoption ist. Viele einst vielversprechende Therapien wie Tipifarnib, ein Inhibitor des Ras-Signalwegs, haben klinisch versagt. Auch klinische Phase-II-Studien mit Erlotinib, das auf den epidermalen Wachstumsfaktor (EFGR) abzielt, und Sorafenib, das auf den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktorrezeptor (VEGF), den Thrombozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor (PDGF) abzielt, und Raf in Kombination mit einer Standard-Chemotherapie haben bei den Patienten kein Ansprechen hervorgerufen.

In den letzten Jahren haben sich funktionelle genomische Screening-Methoden in Kombination mit der genetischen Profilierung von Krebszelllinien als nützlich erwiesen, um essentielle zytoplasmatische Signalwege zu identifizieren und zielspezifische Therapien zu entwickeln. Bei seltenen Tumorarten wird zunehmend eine Variante dieses Ansatzes, die sogenannte speziesübergreifende vergleichende Onkogenomik, eingesetzt, um neue therapeutische Ziele zu identifizieren. In der artübergreifenden vergleichenden Onkogenomik werden genetische Profilierung und funktionelle Genomik in gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEM) durchgeführt und die Ergebnisse dann in den seltenen menschlichen Proben und Zelllinien validiert, die zur Verfügung stehen.

In diesem Artikel wird beschrieben, wie Kandidaten-Treibergenmutationen in menschlichen und Maus-MPNST-Zellen mittels Whole-Exom-Sequenzierung (WES) identifiziert werden können. Anschließend beschreiben wir, wie shRNA-Screenings auf Genomebene durchgeführt werden können, um kritische Signalwege in MPNST-Zellen von Mäusen und Menschen zu identifizieren und zu vergleichen und medikamentöse Ziele in diesen Signalwegen zu identifizieren. Diese Methoden bieten einen effektiven Ansatz zur Identifizierung neuer therapeutischer Ziele bei einer Vielzahl von Krebsarten beim Menschen.

Introduction

Maligne periphere Nervenscheidentumoren (MPNSTs) sind hochaggressive Spindelzellneoplasien, die in Verbindung mit dem Tumor-Suszeptibilitätssyndrom Neurofibromatose Typ 1 (NF1) sporadisch in der Allgemeinbevölkerung und an Stellen früherer Strahlentherapie auftreten ^1,2,3. NF1-Patienten werden mit einer Wildtyp-Kopie des NF1-Tumorsuppressorgens und einem zweiten NF1-Allel mit einer Loss-of-Function-Mutation geboren. Dieser Zustand der Haploinsuffizienz macht NF1-Patienten anfällig für eine zweite Loss-of-Function-Mutation in ihrem Wildtyp-NF1-Gen, die die Tumorgenese auslöst. Wenn diese “Second Hit”-NF1-Mutation in einer Zelle der Schwann-Zelllinie auftritt, ist der resultierende Tumor entweder ein dermales Neurofibrom, das in der Haut entsteht, oder ein plexiformes Neurofibrom, das sich in großen Nerven oder Nervengeflechten entwickelt. Obwohl die Pathologie dermaler und plexiformer Neurofibrome identisch ist, ist ihr biologisches Verhalten sehr unterschiedlich – obwohl sowohl dermale als auch plexiforme Neurofibrome gutartig sind, können nur plexiforme Neurofibrome eine Transformation durchlaufen und MPNSTs hervorrufen. Neben dem Verlust von Neurofibromin, dem Ras-GTPase-aktivierenden Protein, das vom NF1-Gen kodiert wird, tragen MPNSTs Mutationen mehrerer anderer Tumorsuppressorgene, darunter TP53 4,5,6,7, CDKN2A ^8,9 und PTEN 10, Mutationen von Genen, die für Komponenten des Polycomb-Repressionskomplexes 2 ^11,12 (PRC2; die SUZ12– und EED-Gene) und aberrante Expression von Rezeptor-Tyrosinkinasen ^1,2. Mutationen von NF1 und den anderen oben genannten Genen sind auch in sporadischen und strahleninduzierten MPNSTs vorhanden^11,12.

Obwohl diese Fortschritte in unserem Verständnis der genomischen Anomalien in MPNSTs von unschätzbarem Wert für das Verständnis ihrer Pathogenese waren, haben sie noch nicht zur Entwicklung wirksamer neuer Therapien für MPNSTs geführt. Ein großes Hindernis für die Entwicklung neuer Therapien ist die Tatsache, dass MPNSTs seltene Krebsarten sind. Aus diesem Grund ist es schwierig, die große Anzahl von Patientenproben zu erhalten, die für globale Analysen zur Definition wichtiger Treibermutationen erforderlich sind, wie sie vom Cancer Genome Atlas (TCGA) durchgeführt werden. Unserer Erfahrung nach kann es Jahre dauern, selbst eine bescheidene Anzahl menschlicher MPNST-Exemplare zu sammeln. Um solche Einschränkungen zu überwinden, haben sich viele Forscher, die andere seltene Krebsarten untersuchen, der Verwendung der vergleichenden Onkogenomik zwischen verschiedenen Spezies zugewandt, um wesentliche Treibergenmutationen zu identifizieren, die wesentlichen zytoplasmatischen Signalwege in ihrem interessierenden Tumor zu definieren und neue therapeutische Ziele zu identifizieren. Da die Signalwege, die für die Tumorentstehung essentiell sind, zwischen Menschen und anderen Wirbeltierarten hochkonserviert sind, kann die Anwendung funktioneller Genomik-Ansätze wie shRNA-Screenings auf Genomebene ein wirksames Mittel sein, um diese neuen Treibermutationen, Signalwege und therapeutischen Ziele zu identifizieren 13,14,15,16,17,18,19 , insbesondere bei der Untersuchung seltener menschlicher Tumorarten, die in begrenzter Anzahl verfügbar sind²⁰.

In den hier vorgestellten Methoden beschreiben wir diesen Ansatz zur Durchführung von genomischen Profilen in humanen MPNST-Zelllinien und frühen MPNST-Kulturen, die von P 0-GGFβ3-Mäusen stammen, einem gentechnisch veränderten Mausmodell (GEM), in dem die Schwann-Zell-spezifische Überexpression des Wachstumsfaktors Neuregulin-1 (NRG1) die Pathogenese plexiformer Neurofibrome und deren anschließende Progression zu MPNSTs fördert^{21, 22,23}. Der erste Schritt in diesem Ansatz besteht darin, Kandidatentreibergene in P 0-GGFβ3-MPNSTs, humanen MPNST-Zelllinien und chirurgisch resezierten humanen MPNSTs zu identifizieren. Um die Signalwege, die von diesen Mutationen betroffen sind, funktionell zu validieren, verwenden wir dann shRNA-Screenings auf Genomebene, um die Gene zu identifizieren, die für die Proliferation und das Überleben in menschlichen und Maus-MPNST-Zelllinien erforderlich sind. Nachdem wir die Gene identifiziert haben, die für die Proliferation und das Überleben erforderlich sind, identifizieren wir die medikamentösen Genprodukte innerhalb der Sammlung von “Treffern” mit Hilfe der Drug Gene Interaction Database. Wir vergleichen auch die “Treffer” in menschlichen und Maus-MPNST-Zellen, um festzustellen, ob das GEM-Modell und die menschlichen MPNSTs eine ähnliche Abhängigkeit von denselben Genen und Signalwegen aufweisen. Die Identifizierung von Überlappungen in den Genen, die für die Proliferation und das Überleben erforderlich sind, und den betroffenen Signalwegen dient als Mittel zur Validierung des P 0-GGFβ3-Mausmodells auf molekularer Ebene. Dieser Ansatz unterstreicht auch die Wirksamkeit der Kombination von Human- und Mausbildschirmen, um neue therapeutische Ziele zu identifizieren, wobei das Mausmodell als Ergänzung zu den menschlichen Bildschirmen dienen kann. Der Wert dieses speziesübergreifenden Ansatzes zeigt sich besonders bei der Suche nach therapeutischen Zielen in seltenen Tumoren, bei denen menschliche Tumore und Zelllinien schwer zu gewinnen sind.

Protocol

Lassen Sie vor Beginn der Studien Tierverfahren und -protokolle für den Umgang mit viralen Vektoren vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und dem Institutional Biosafety Committee (IBC) überprüfen und genehmigen. Die hier beschriebenen Verfahren wurden von den IACUC- und IBC-Gremien der Medical University of South Carolina genehmigt und von entsprechend geschultem Personal in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und den institutionellen Tierpflegericht…

Representative Results

Abbildung 5 zeigt die Depletionswerte von essentiellen Kerngenen (CEGs), die als WAHR markiert sind, im Vergleich zu Nicht-CEGs (als FALSCH markiert) in jeder gescreenten menschlichen Zelllinie. Die Punkte stellen log2 der Fold-Depletion-Scores für einzelne Gene dar, die über einer Boxplot-Darstellung der Gesamtscore-Verteilung dargestellt werden. Der Student’s t-Test wurde verwendet, um einen signifikanten Unterschied im Mittelwert der Depletionswerte zwischen den beiden Gruppen …

Discussion

Die hier vorgestellten detaillierten Methoden wurden entwickelt, um die Neoplasie des peripheren Nervensystems und die MPNST-Pathogenese zu untersuchen. Obwohl wir festgestellt haben, dass diese Methoden effektiv sind, sollten wir uns darüber im Klaren sein, dass es einige potenzielle Einschränkungen für die hier beschriebenen Methoden gibt. Im Folgenden diskutieren wir einige dieser Einschränkungen und mögliche Strategien, um sie in anderen Modellsystemen zu überwinden.

Wir haben heraus…

Materials

Bioruptor Sonication System	Diagenode	UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot	Illumina, San Diego, CA	N/A
Celigo Image Cytometer	Nexcelom	N/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve Hybrid	Decon Laboratories	5989-27-5
Corning 96-well Black Microplate	Millipore Sigma	CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes	Diagenode	C30010009
dNTP mix	Clontech	639210
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Elution buffer	Qiagen	19086
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Excel	Microsoft
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’			HPLC purified
GraphPad Prism	Dotmatics
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Illumina HiScanSQ	Illumina, San Diego, CA	N/A
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
PLUS Transfection Reagent	Thermo Scientific	11514015
Polybrene Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR1003G
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Qiagen Buffer P1	Qiagen	19051
Qiagen Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymerase	Clontech	639210
Trimmomatic software		www.usadellab.org