遗传分析和基因组规模的辍学筛选以确定恶性周围神经鞘瘤小鼠模型中的治疗靶点
Summary
我们开发了一种跨物种比较肿瘤基因组学方法，利用基因组分析和功能基因组筛选来识别和比较基因工程小鼠模型中产生的肿瘤和相应的人类肿瘤类型的治疗靶点。
Abstract
恶性周围神经鞘瘤 （MPNST） 来源于雪旺细胞或其前体。在肿瘤易感综合征 1 型神经纤维瘤病 （NF1） 患者中，MPNST 是最常见的恶性肿瘤，也是导致死亡的主要原因。这些罕见且具有侵袭性的软组织肉瘤前景广阔，5 年无病生存率为 34-60%。MPNST患者的治疗选择非常有限，其中毁容手术是最重要的治疗选择。许多曾经很有前途的疗法，如Ras信号传导抑制剂tipifarnib，在临床上都失败了。同样，靶向表皮生长因子（EFGR）的厄洛替尼和靶向血管内皮生长因子受体（VEGF）、血小板衍生生长因子受体（PDGF）和Raf的索拉非尼联合标准化疗的II期临床试验也未能在患者中产生反应。
近年来，功能基因组筛选方法与癌细胞系的遗传分析相结合，已被证明可用于识别基本的细胞质信号通路和靶点特异性疗法的开发。在罕见肿瘤类型的情况下，这种方法的一种变体被称为跨物种比较肿瘤基因组学，越来越多地被用于确定新的治疗靶点。在跨物种比较肿瘤基因组学中，在基因工程小鼠（GEM）模型中进行遗传分析和功能基因组学，然后在可用的稀有人类标本和细胞系中验证结果。
本文介绍了如何使用全外显子组测序（WES）鉴定人和小鼠MPNST细胞中的候选驱动基因突变。然后，我们描述了如何进行基因组规模的shRNA筛选，以识别和比较小鼠和人类MPNST细胞中的关键信号通路，并确定这些通路中的可成药靶点。这些方法为识别各种人类癌症类型的新治疗靶点提供了一种有效的方法。
Introduction
恶性周围神经鞘瘤 （MPNST） 是高度侵袭性的梭形细胞肿瘤，与肿瘤易感综合征 1 型神经纤维瘤病 （NF1） 相关，散发于普通人群和既往放疗部位1,2,3。NF1 患者出生时具有 NF1 抑癌基因的野生型拷贝和具有功能丧失突变的第二个 NF1 等位基因。这种单倍体功能不全的状态使 NF1 患者易受其野生型 NF1 基因的第二次功能丧失突变的影响，从而触发肿瘤发生。当这种“第二次命中”NF1突变发生在雪旺细胞谱系的细胞中时，产生的肿瘤要么是皮肤中出现的真皮神经纤维瘤，要么是发生在大神经或神经丛中的丛状神经纤维瘤。虽然真皮和丛状神经纤维瘤的病理学相同，但它们的生物学行为却大不相同——虽然真皮和丛状神经纤维瘤都是良性的，但只有丛状神经纤维瘤才能发生转化并产生MPNST。除了神经纤维蛋白（由 NF1 基因编码的 Ras GTP 酶激活蛋白）的缺失外，MPNST 还携带多种其他抑癌基因的突变，包括 TP53 4,5,6,7、CDKN2A 8,9 和 PTEN 10，编码多梳抑制复合物 2 11,12 （PRC2; SUZ12 和 EED 基因）和受体酪氨酸激酶的异常表达 1,2。NF1 和上述其他基因的突变也存在于散发和辐射诱导的 MPNST中 11,12。
虽然我们对MPNSTs基因组异常的理解的这些进展对于理解其发病机制非常宝贵，但它们尚未导致MPNSTs的有效新疗法的开发。阻碍新疗法开发的一个主要障碍是MPNST是罕见的癌症。正因为如此，很难获得定义关键驱动突变的全球分析所需的大量患者样本，例如癌症基因组图谱 （TCGA） 进行的分析。根据我们的经验，即使积累少量的人类MPNST标本也可能需要数年时间。为了克服这些局限性，许多研究其他罕见癌症类型的研究人员已转向使用跨物种比较肿瘤基因组学来识别重要的驱动基因突变，定义其感兴趣的肿瘤中的基本细胞质信号通路，并确定新的治疗靶点。由于对肿瘤发生至关重要的信号通路在人类和其他脊椎动物物种之间高度保守，因此应用功能基因组学方法（如基因组规模的shRNA筛选）可以成为识别这些新的驱动突变、信号通路和治疗靶点的有效手段13,14,15,16,17,18,19，特别是在研究有限的人类肿瘤类型时，数量限制为20。
在这里介绍的方法中，我们描述了这种在人 MPNST 细胞系和源自 P 0-GGFβ3 小鼠的早期传代 MPNST 培养物中进行基因组分析的方法，这是一种基因工程小鼠模型 （GEM），其中生长因子神经调节蛋白-1 （NRG1） 的雪旺细胞特异性过表达促进丛状神经纤维瘤的发病机制及其随后进展为 MPNST21，22,23.该方法的第一步是鉴定 P 0-GGFβ3 MPNSTs、人 MPNST 细胞系和手术切除的人 MPNST 中的候选驱动基因。为了在功能上验证受这些突变影响的信号通路，我们然后使用基因组规模的shRNA筛选来鉴定人和小鼠MPNST细胞系中增殖和存活所需的基因。在确定增殖和存活所需的基因后，我们使用药物基因相互作用数据库在“命中”集合中识别可成药的基因产物。我们还比较了人和小鼠MPNST细胞中的“命中”，以确定GEM模型和人类MPNST是否表现出对相同基因和信号通路的相似依赖性。鉴定增殖和存活所需的基因重叠以及受影响的信号通路可作为在分子水平上验证P 0-GGFβ3小鼠模型的一种手段。这种方法还强调了结合人类和小鼠筛选来识别新的治疗靶点的有效性，其中小鼠模型可以作为人类筛选的补充。在人类肿瘤和细胞系难以获得的罕见肿瘤中寻找治疗靶点时，这种跨物种方法的价值尤为明显。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文介绍的详细方法旨在研究周围神经系统肿瘤和MPNST发病机制。尽管我们发现这些方法是有效的，但应该认识到，我们在这里描述的方法存在一些潜在的局限性。下面，我们将讨论其中的一些局限性以及在其他模型系统中克服这些局限性的潜在策略。
我们发现全外显子组测序可有效识别 P 0-GGFβ3 小鼠中感兴趣的突变。然而，应该认识到，整个外显子组测序本身也有?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国国家神经疾病和中风研究所（R01 NS048353和R01 NS109655 to SLC;R01 NS109655-03S1 至 D.P.J.）、美国国家癌症研究所（R01 CA122804 至 S.L.C.）和国防部（X81XWH-09-1-0086 和 W81XWH-12-1-0164 至 S.L.C.）。
Materials
| Bioruptor Sonication System | Diagenode | UCD-600 | |
| CASAVA 1.8.2 | |||
| Cbot | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software | |||
| Citrisolve Hybrid | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Corning 96-well Black Microplate | Millipore Sigma | CLS3603 | |
| Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes | Diagenode | C30010009 | |
| dNTP mix | Clontech | 639210 | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Elution buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’ | |||
| FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’ | |||
| GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’ | HPLC purified | ||
| GraphPad Prism | Dotmatics | ||
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Illumina HiScanSQ | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| PLUS Transfection Reagent | Thermo Scientific | 11514015 | |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR1003G | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Qiagen Buffer P1 | Qiagen | 19051 | |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’ | |||
| RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’ | |||
| Titanium Taq polymerase | Clontech | 639210 | |
| Trimmomatic software | www.usadellab.org |
Referências
- Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).
- Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent Advances in the Diagnosis and Pathogenesis of Neurofibromatosis Type 1 (NF1)-associated Peripheral Nervous System Neoplasms. Adv Anat Pathol. 25 (5), 353-368 (2018).
- Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Adv Cancer Res. 153, 305-341 (2022).
- Birindelli, S., et al. Rb and TP53 pathway alterations in sporadic and NF1-related malignant peripheral nerve sheath tumors. Lab Invest. 81 (6), 833-844 (2001).
- Legius, E., et al. TP53 mutations are frequent in malignant NF1 tumors. Genes Chromosomes Cancer. 10 (4), 250-255 (1994).
- Menon, A. G., et al. Chromosome 17p deletions and p53 gene mutations associated with the formation of malignant neurofibrosarcomas in von Recklinghausen neurofibromatosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (14), 5435-5439 (1990).
- Upadhyaya, M., et al. Germline and somatic NF1 gene mutation spectrum in NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs). Hum Mutat. 29 (1), 74-82 (2008).
- Kourea, H. P., Orlow, I., Scheithauer, B. W., Cordon-Cardo, C., Woodruff, J. M. Deletions of the INK4A gene occur in malignant peripheral nerve sheath tumors but not in neurofibromas. Am J Pathol. 155 (6), 1855-1860 (1999).
- Nielsen, G. P., et al. Malignant transformation of neurofibromas in neurofibromatosis 1 is associated with CDKN2A/p16 inactivation. Am J Pathol. 155 (6), 1879-1884 (1999).
- Gregorian, C., et al. PTEN dosage is essential for neurofibroma development and malignant transformation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (46), 19479-19484 (2009).
- Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1227-1232 (2014).
- Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1170-1172 (2014).
- Varela, I., et al. Somatic structural rearrangements in genetically engineered mouse mammary tumors. Genome Biol. 11 (10), 100 (2010).
- Johnson, R. A., et al. Cross-species genomics matches driver mutations and cell compartments to model ependymoma. Nature. 466 (7306), 632-636 (2010).
- Kim, M., et al. Comparative oncogenomics identifies NEDD9 as a melanoma metastasis gene. Cell. 125 (7), 1269-1281 (2006).
- Zender, L., et al. Identification and validation of oncogenes in liver cancer using an integrative oncogenomic approach. Cell. 125 (7), 1253-1267 (2006).
- Uren, A. G., et al. Large-scale mutagenesis in p19(ARF)- and p53-deficient mice identifies cancer genes and their collaborative networks. Cell. 133 (4), 727-741 (2008).
- Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323 (5922), 1747-1750 (2009).
- Dupuy, A. J., et al. A modified sleeping beauty transposon system that can be used to model a wide variety of human cancers in mice. Cancer Res. 69 (20), 8150-8156 (2009).
- Carroll, S. L. The Challenge of Cancer Genomics in Rare Nervous System Neoplasms: Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors as a Paradigm for Cross-Species Comparative Oncogenomics. Am J Pathol. 186 (3), 464-477 (2016).
- Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. J Neurosci. 23 (19), 7269-7280 (2003).
- Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. Am J Pathol. 182 (3), 646-667 (2013).
- Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathol. 127 (4), 573-591 (2014).
- Hart, T., Brown, K. R., Sircoulomb, F., Rottapel, R., Moffat, J. Measuring error rates in genomic perturbation screens: gold standards for human functional genomics. Mol Syst Biol. 10 (7), 733 (2014).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens. G3. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Sci Rep. 11 (1), 5690 (2021).
- Maser, R. S., et al. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447 (7147), 966-971 (2007).
- Rahrmann, E. P., et al. Forward genetic screen for malignant peripheral nerve sheath tumor formation identifies new genes and pathways driving tumorigenesis. Nat Genet. 45 (7), 756-766 (2013).
