Optimierte automatisierte Analyse der homöostase-Modulation lebender neuronaler Mitochondrien durch isoformspezifische Retinsäurerezeptoren
Summary
Das mitochondriale Netzwerk ist extrem komplex, was die Analyse sehr schwierig macht. Ein neuartiges MATLAB-Tool analysiert konfokal abgebildete Mitochondrien in Zeitrafferbildern, führt jedoch zu einem großen Ausgabevolumen, das individuelle manuelle Aufmerksamkeit erfordert. Um dieses Problem zu lösen, wurde eine Routineoptimierung entwickelt, die eine schnelle Dateianalyse ermöglicht.
Abstract
Das komplexe mitochondriale Netzwerk macht es sehr schwierig, lebende Zellen zu segmentieren, zu verfolgen und zu analysieren. MATLAB-Tools ermöglichen die Analyse von Mitochondrien in Zeitrafferdateien und vereinfachen und beschleunigen den Prozess der Bildverarbeitung erheblich. Nichtsdestotrotz produzieren bestehende Werkzeuge ein großes Ausgabevolumen, das individuelle manuelle Aufmerksamkeit erfordert, und einfache Versuchsaufbauten haben eine Ausgabe von Tausenden von Dateien, die jeweils eine umfangreiche und zeitaufwändige Handhabung erfordern.
Um diese Probleme zu lösen, wurde eine routinemäßige Optimierung entwickelt, sowohl in MATLAB-Code- als auch in Live-Skript-Form, die eine schnelle Dateianalyse ermöglicht und das Lesen und die Datenverarbeitung von Dokumenten erheblich reduziert. Mit einer Geschwindigkeit von 100 Dateien/min ermöglicht die Optimierung eine insgesamt schnelle Analyse. Die Optimierung erzielt die Ergebnisse durch die Mittelung rahmenspezifischer Daten für einzelne Mitochondrien über Zeiträume hinweg und analysiert die Daten auf definierte Weise, die mit den Ergebnissen bestehender Tools übereinstimmt. Die konfokale Live-Bildgebung wurde mit dem Farbstoff Tetramethylrhodaminmethylester durchgeführt, und die Routineoptimierung wurde durch die Behandlung neuronaler Zellen mit Retinsäurerezeptor (RAR)-Agonisten validiert, deren Auswirkungen auf neuronale Mitochondrien in der Literatur nachgewiesen sind. Die Ergebnisse stimmten mit der Literatur überein und ermöglichten eine weitere Charakterisierung des mitochondrialen Netzwerkverhaltens als Reaktion auf die isoformspezifische RAR-Modulation.
Diese neue Methodik ermöglichte eine schnelle und validierte Charakterisierung des Mitochondriennetzwerks von Ganzneuronen, aber auch die Unterscheidung zwischen Axon- und Zellkörpermitochondrien, ein wesentliches Merkmal für die Anwendung im neurowissenschaftlichen Bereich. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auf Experimente mit schnell wirkenden Behandlungen angewendet werden, die die Bildgebung derselben Zellen vor und nach Behandlungen ermöglichen und über das Gebiet der Neurowissenschaften hinausgehen.
Introduction
Zelluläre Mitochondrien befinden sich im Zentrum aller physiologischen Zustände, und ein gründliches Verständnis ihrer Homöostase (Mitostase) und ihres Verhaltens ist von größter Bedeutung, um eine pharmakologische Behandlung für eine Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Krebs und Alzheimer, zu identifizieren 1,2.
Mitochondrien spielen eine entscheidende zelluläre Rolle bei der Energiehomöostase, der ATP-Erzeugung, der Kalziumpufferung und der ROS-Regulation, und die Mitostase ist für die Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase unerlässlich, da molekulare Chaperone energieabhängig sind3. Diese erfordern eine konstante und dynamische Netzwerkmodulation und -anpassung, um die zellulären Bedürfnisse effizient zu erfüllen, und der Mitochondrientransport wird durch verschiedene Signalwege reguliert; frühere Arbeiten haben einen solchen Signalweg beschrieben, den der Retinsäurerezeptoren (RARs)4,5. Retinsäure (RA) fördert das Wachstum von Axonen und Neuriten durch RAR-Aktivierung. In primären kortikalen Neuronen der Maus fördert die Aktivierung von RAR-β das mitochondriale Wachstum, die Geschwindigkeit und die Beweglichkeit im Neuriten6.
In Anbetracht der Anpassungsfähigkeit und Dynamik des mitochondrialen Netzwerks ist die Möglichkeit, die Mitostase in “Echtzeit” zu bewerten, nicht nur für die Untersuchung der Energiehomöostase, sondern auch für die Proteostase, die Zellgesundheit, die Proliferation oder die Signalübertragung unerlässlich. Eine häufig verwendete Methode zur Beurteilung der Mitostase beruht auf der konfokalen Mikroskopie nach Hervorhebung der Mitochondrien mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder -marker sowie einem spezifischen Mikroskopieaufbau, der eine Temperatur- und/oder CO2 -Regulierung ermöglicht7. Bei dieser Art von Versuchsaufbau wird jeweils eine experimentelle Wiederholung durchgeführt. Zusätzlich zur experimentellen Wiederholung verschiedener Behandlungen sollte berücksichtigt werden, dass die meisten Experimente ihre technischen Replikate haben sollten (bei denen mehr als eine Position pro Platte abgebildet wird), wobei eine Reihe von Fokusebenen (z-Stapeln) in einer Reihe von Zeitpunkten aufgezeichnet wird. So ergibt ein Versuchsdesign mit drei Wiederholungen einer Kontrolle und zwei Behandlungen, mit fünf Bildgebungspositionen pro Platte und 15 Zeitpunkten, 225 zu bearbeitende Stacks. Klassischerweise wurden Videos von lebenden Mitochondrien analysiert, indem Kymographen geplottet wurden, die einzeln analysiert wurden8, in einem zeitaufwändigen Prozess, der umfangreiche manuelle Eingaben erforderte, selbst wenn man sich auf Computertools stützte.
Kürzlich wurde ein Algorithmus beschrieben9 , der eine automatisierte Segmentierung und Verfolgung von Mitochondrien in lebenden 2D- und 3D-Zeitrafferdateien ermöglicht. Es gibt andere Quantifizierungstechniken, die alle ihre Grenzen haben10. Mitometer, eine automatisierte Open-Source-Anwendung, eignet sich besonders für Zeitraffer- und Mitochondriendynamikanalysen, die nur geringe Benutzereingaben erfordern. Diese Anwendung hat eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen bestehenden MATLAB-basierten Werkzeugen, nämlich die automatische Verarbeitung einzelner TIF-Stacks unter Verwendung von bis zu 13 verschiedenen Parametern, was besonders für die Neurowissenschaften interessant ist, da sie zwischen peri- und telenukleären Mitochondrien unterscheidet.
Bei einem Experiment wie dem oben beschriebenen ergeben diese 13 Parameter, die auf 225 Stapel angewendet werden, jedoch 2.925 einzelne Ausgabedateien. Diese erfordern vier einzelne Computereingaben, was sich auf über 10.000 manuelle Eingaben summiert, die zum Herunterladen aller Ausgabedateien erforderlich sind. Bei großen Versuchsdesigns führt dies zu einer unnötig extrem zeitaufwändigen Analyse jeder Datei und Datenintegration. Hier stellen wir eine Routineoptimierung vor, die eine schnelle Dateianalyse ermöglicht, das Lesen und die Datenverarbeitung von Dokumenten erheblich reduziert und Daten auf definierte Weise analysiert, die mit der Ausgabe bestehender Tools übereinstimmt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Bildgebung lebender Zellen erzeugt große Dateien, die eine ernsthafte Computerverarbeitung erfordern, aber selbst die neuesten Tools erfordern umfangreiche manuelle Eingaben zur Verarbeitung. Diese Routineoptimierung konzentriert sich auf die Vereinfachung des Prozesses der Mitochondrienanalyse auf dem Mitometer, da dieses Tool ein sehr gutes Gleichgewicht zwischen Benutzereingabe und Datenausgabe bietet. Ein umfassender Vergleich zwischen verschiedenen Werkzeugen für die Mitochondrien-Bildanalyse wurde zuvor über…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Bildaufnahme wurde in der LiM-Einrichtung von iBiMED, einem Knoten von PPBI (Portuguese Platform of BioImaging), durchgeführt: POCI-01-0145-FEDER-022122. Diese Arbeit wurde unterstützt durch FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276), ein Stipendium für DT von der Fundação para a Ciência e Tecnologia des Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), ein Stipendium von ATG-The Gabba Alumni Association an VP und das Institute for Biomedicine-iBiMED, University of Aveiro.
Materials
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
Referências
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