Análise Automatizada Otimizada da Modulação da Homeostase das Mitocôndrias Neuronais Vivas por Receptores de Ácido Retinóico Isoform-Específicos
Summary
A rede mitocondrial é extremamente complexa, tornando-a muito difícil de analisar. Uma nova ferramenta MATLAB analisa mitocôndrias confocais ao vivo em imagens de timelapse, mas resulta em um grande volume de saída que requer atenção manual individual. Para resolver esse problema, uma otimização de rotina foi desenvolvida, permitindo uma análise rápida dos arquivos.
Abstract
A complexa rede mitocondrial torna muito desafiador segmentar, acompanhar e analisar células vivas. As ferramentas MATLAB permitem a análise de mitocôndrias em arquivos timelapse, simplificando e acelerando consideravelmente o processo de processamento de imagens. No entanto, as ferramentas existentes produzem um grande volume de saída, exigindo atenção manual individual, e as configurações experimentais básicas têm uma saída de milhares de arquivos, cada um exigindo manuseio extenso e demorado.
Para resolver essas questões, uma otimização de rotina foi desenvolvida, tanto em código MATLAB quanto em formulários live-script, permitindo uma análise rápida de arquivos e reduzindo significativamente a leitura de documentos e o processamento de dados. Com uma velocidade de 100 arquivos/min, a otimização permite uma análise geral rápida. A otimização alcança a saída de resultados pela média de dados específicos de quadros para mitocôndrias individuais ao longo de períodos de tempo, analisando dados de maneira definida, consistente com a saída de ferramentas existentes. Imagens confocais ao vivo foram realizadas usando o corante tetrametilrodamina éster, e a otimização de rotina foi validada pelo tratamento de células neuronais com agonistas do receptor do ácido retinóico (RAR), cujos efeitos sobre as mitocôndrias neuronais estão estabelecidos na literatura. Os resultados foram consistentes com a literatura e permitiram uma caracterização mais detalhada do comportamento das redes mitocondriais em resposta à modulação RAR isoform-específica.
Esta nova metodologia permitiu a caracterização rápida e validada da rede mitocondrial de neurônios inteiros, mas também permite a diferenciação entre axônio e mitocôndrias de corpo celular, uma característica essencial para aplicação no campo da neurociência. Além disso, esse protocolo pode ser aplicado a experimentos utilizando tratamentos de ação rápida, permitindo a obtenção de imagens das mesmas células antes e após os tratamentos, transcendendo o campo da neurociência.
Introduction
As mitocôndrias celulares estão no centro de todos os estados fisiológicos, e uma compreensão completa de sua homeostase (mitostase) e comportamento é fundamental para auxiliar na identificação do tratamento farmacológico para uma ampla gama de doenças, incluindo câncer e doença de Alzheimer 1,2.
As mitocôndrias desempenham papéis celulares cruciais na homeostase energética, geração de ATP, tamponamento de cálcio e regulação de EROs, e a mitostase é essencial para manter a homeostase proteica, uma vez que as chaperonas moleculares são dependentes de energia3. Estes requerem uma modulação e adaptação de rede constante e dinâmica para atender eficientemente às necessidades celulares, e o transporte mitocondrial é regulado por diferentes vias de sinalização; trabalhos anteriores descreveram uma dessas vias, a dos receptores do ácido retinóico (RARs)4,5. O ácido retinóico (AR) promove crescimento axonal e neurítico via ativação RAR. Em neurônios corticais primários de camundongos, a ativação do RAR-β estimula o crescimento, a velocidade e a mobilidade mitocondrial no neurito6.
Considerando a adaptabilidade e dinâmica da rede mitocondrial, a possibilidade de avaliar a mitostase em “tempo real” é essencial não apenas para investigar a homeostase energética, mas também para proteostase, saúde celular, proliferação ou sinalização. Um método comumente utilizado para avaliação de mitostases baseia-se na microscopia confocal após o realce mitocondrial usando um corante ou marcador fluorescente, bem como uma configuração de microscopia específica que permite a regulação da temperatura e/ou do CO2 7. Esse tipo de arranjo experimental implica que uma réplica experimental seja realizada de cada vez. Além da repetição experimental de diferentes tratamentos, deve-se considerar que a maioria dos experimentos deve ter suas réplicas técnicas (onde mais de uma posição é imageada por placa), com uma série de planos focais (z-stacks) sendo registrados em uma série de pontos de tempo. Assim, um delineamento experimental com três repetições de um controle e dois tratamentos, com cinco posições de imagem por placa, e 15 pontos de tempo, resultou em 225 pilhas a serem processadas. Classicamente, os vídeos de mitocôndrias vivas eram analisados por meio de quimografias plotadas, que seriam analisadasindividualmente8, em um processo demorado que exigia extensa entrada manual, mesmo quando dependia de ferramentas computacionais.
Recentemente foi descritoum algoritmo 9 que permite segmentação e rastreamento automatizado de mitocôndrias em arquivos time-lapse 2-D e 3-D de células vivas. Outras técnicas de quantificação estão disponíveis e todas apresentam suas limitações10. O mitômetro, um aplicativo automatizado de código aberto, é particularmente adequado para análise de lapso de tempo e dinâmica mitocondrial, exigindo baixa entrada do usuário. Esta aplicação tem uma série de vantagens sobre outras ferramentas existentes baseadas no MATLAB, nomeadamente permitindo o processamento automático de pilhas TIF individuais, utilizando até 13 parâmetros diferentes, particularmente interessantes para as neurociências, uma vez que diferencia entre mitocôndrias peri e telenucleares.
No entanto, para um experimento como o descrito acima, esses 13 parâmetros aplicados a 225 pilhas resultam em 2.925 arquivos de saída individuais. Estes requerem quatro entradas de computador individuais, que somam mais de 10.000 entradas manuais sendo necessárias para baixar todos os arquivos de saída. Para grandes projetos experimentais, isso resulta em uma análise desnecessariamente extremamente demorada de cada arquivo e integração de dados. Aqui apresentamos uma rotina de otimização que permite a análise rápida de arquivos, reduzindo consideravelmente a leitura de documentos e o processamento de dados, analisando os dados de forma definida, consistente com a saída das ferramentas existentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
A imagem de células vivas produz arquivos grandes que exigem processamento de computação sério, mas mesmo as ferramentas mais recentes exigem extensa entrada manual para processar. Esta otimização de rotina é focada em simplificar o processo de análise de mitocôndrias no Mitômetro, pois esta ferramenta apresenta um equilíbrio muito bom entre a entrada do usuário e a saída de dados. Uma comparação abrangente entre diferentes ferramentas para análise de imagens mitocondriais foi previamente revisada<sup cla…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A aquisição das imagens foi realizada no equipamento LiM do iBiMED, um nó do PPBI (Plataforma Portuguesa de BioImagem): POCI-01-0145-FEDER-022122. Este trabalho contou com o apoio da FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276), uma bolsa a DT da Fundação para a Ciência e Tecnologia do Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), uma bolsa da ATG-The Gabba Alumni Association to VP, e do Instituto de Biomedicina-iBiMED, Universidade de Aveiro.
Materials
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
Referências
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