Summary
이 프로토콜은 관류 중인 혈관의 체외 배양을 위해 새로 개발된 3D 프린팅 바이오리액터의 설정 및 작동을 제시합니다. 이 시스템은 다른 사용자가 쉽게 채택할 수 있도록 설계되었으며, 실용적이고 저렴하며 기초 생물학 및 약리학 연구와 같은 다양한 실험 응용 분야에 적용할 수 있습니다.
Abstract
혈관 질환은 전 세계적으로 사망률과 이환율의 주요 원인으로 남아 있는 대부분의 심혈관 질환(CVD)의 기초를 형성합니다. 혈관 질환을 예방하고 치료하기 위한 효과적인 수술 및 약리학적 개입이 시급히 필요합니다. 부분적으로, 중개 모델의 부족은 혈관 질환과 관련된 세포 및 분자 과정에 대한 이해를 제한합니다. 체외 관류 배양 바이오리액터는 체외 배양의 용이성과 살아있는 조직의 복잡성을 결합하여 통제된 동적 환경에서 대형 동물 혈관(인간 포함)을 연구하는 데 이상적인 플랫폼을 제공합니다. 그러나 대부분의 바이오리액터는 맞춤형으로 제조되기 때문에 채택이 어려워 결과의 재현성이 제한됩니다. 이 백서는 모든 생물학 실험실에서 쉽게 생산 및 적용할 수 있는 3D 프린팅 시스템을 제시하고 설정에 대한 자세한 프로토콜을 제공하여 사용자가 작동할 수 있도록 합니다. 이 혁신적이고 재현 가능한 ex vivo 관류 배양 시스템은 생리학적 조건에서 최대 7일 동안 혈관을 배양할 수 있습니다. 표준화된 관류 생물반응기를 채택하면 대형 동물 혈관의 생리학적 및 병리학적 과정을 더 잘 이해하고 새로운 치료법의 발견을 가속화할 수 있을 것으로 기대합니다.
Introduction
혈관벽은 반응성 안정 상태로 존재하며, 이는 외부 자극(예: 압력 변화, 혈관 수축제)에 대한 반응성과 혈액 응고 및 염증성 세포 침투를 방지하는 일관된 비활성화 표면을 보장합니다1. 노화 및 생활 습관에 따른 자극과 직접적인 손상에 반응하여 혈관벽은 허혈성 뇌졸중 및 심근경색과 같은 일반적인 심혈관 질환(CVD)의 원인으로 알려진 재협착 및 죽상동맥경화증과 같은 리모델링 과정을 활성화한다2. 경피적 혈관재생술과 스텐트 삽입술과 같은 중재적 접근법은 혈관 질환의 진행된 증상을 해결하기 위해 사용할 수 있지만, 이는 추가적인 혈관 손상을 유발하여 종종 재발로 이어지는 것으로 알려져 있습니다. 또한 제한된 예방 및 초기 단계 솔루션만 사용할 수 있습니다. 혈관 벽 항상성을 유지하고 기능 장애를 유발하는 메커니즘을 이해하는 것이 새로운 치료법 개발의 핵심입니다3.
분자 생물학 및 조직 공학의 끊임없는 발전과 발전에도 불구하고 동물 연구는 혈관 생물학 연구의 중요한 구성 요소로 남아 있습니다. 생체 내 동물 연구는 혈관 항상성 및 병리학의 메커니즘에 대한 엄청난 통찰력을 제공했습니다. 그러나 이러한 절차는 비용이 많이 들고 처리량이 상대적으로 낮으며 상당한 윤리적 문제를 제기합니다. 또한, 작은 동물은 인간의 혈관 생리학을 잘 대표하지 못하며, 대규모 동물 실험은 훨씬 더 비싸고 더 많은 윤리적 고려 사항을 야기합니다 4,5. 급속한 고령화 인구를 위한 제약 및 의료 솔루션에 대한 수요가 증가함에 따라 동물 사용의 단점이 확대되어 결과의 재현성, 신뢰성 및 환자 치료로의 이전 가능성에 영향을 미치고 있습니다6.
체 외 시스템은 기본 기전을 연구할 수 있는 단순화된 플랫폼을 제공하지만, 혈관 질환 발병의 중요한 결정 요인인 전체 조직의 복잡성, 세포와 세포외 기질 간의 상호 작용, 기계적 힘을 요약하지 못한다7.
인위적으로 통제된 환경에서 유지되는 전체 조직에 대해 수행된 생체 외 연구는 in vivo 복잡성을 모방하는 동시에 상대적으로 높은 처리량의 조사를 가능하게 한다8. 배양 조건과 환경을 면밀히 제어할 수 있는 능력을 감안할 때, 체외 모델은 광범위한 복잡한 연구를 가능하게 하고 혈관 생물학에서 동물 절차의 사용을 줄이기 위한 적절한 대안을 제공합니다. 정적 혈관 고리 배양은 흥미로운 통찰력을 제공했지만 중요한 혈역학적 요소(9)를 통합하지 못했습니다. 실제로, 생체 외 혈관계 연구는 혈관 벽 내의 세포에 적용되는 많은 동적 힘과 관련된 특정 문제를 제기합니다. 발광 흐름, 난류, 전단 응력, 압력 및 벽 변형과 같은 자극은 조직 병태생리학에 상당한 영향을 미친다10,11,12.
관류 생물반응기는 혈관 항상성을 연구하고 부상 또는 혈류역학적 변화에 대응하여 리모델링하는 데 필수적이다13. 또한, 관류 배양은 조직 공학 혈관(TEBV)의 성숙 및 내구성을 개선하는 데 사용될 수 있으며, 혈관 이식편에 적합한 대안을 제공할 수 있다14.
상업적으로 이용 가능한 관류 생물 반응기는 유연성과 적응성이 제한적이며 비용이 많이 듭니다. 기존의 자체 개발 된 바이오 리액터 중 다수는 특수 제작 된 구성 요소 7,8,9,10,11,12의 제한된 설명과 사용할 수 없기 때문에 다른 실험실에서 복제하기가 어렵습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 우리는 최근 새로운 바이오리액터(EasyFlow)를 개발했는데, 이 바이오리액터는 생산이 경제적이고, 다양한 조직을 수용할 수 있으며, 다양한 연구 요구에 적응하기 위해 비교적 간단한 수정이 가능하다13. 인서트는 3D 프린팅되어 표준 50mL 원심분리 튜브의 뚜껑에 맞습니다. 모듈식 설계와 3D 프린팅 제조를 통해 다양한 실험실에서 접근 및 재현할 수 있을 뿐만 아니라 다양한 과학적 요구에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 동맥 관류 설정에서 생물반응기 시스템의 조립 및 기본 작동을 설명합니다.
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Protocol
이 프로토콜은 두 개의 EasyFlow(생물반응기) 인서트로 구성된 시스템의 조립 및 사용에 대해 설명하는데, 하나는 관류 동맥 시료를 포함하는 반응 챔버(C)를 나타내고 다른 하나는 중간 저장소(R)로 작동합니다(그림 1 및 그림 2A). 경동맥은 영국 Pirbright Institute에서 4-6주 된 수컷과 암컷 새끼 돼지(6-12kg)에서 채취했습니다. 동물 시술은 내무부 동물(과학적 절차)법(1986)(ASPA)에 따라 수행되었으며 Pirbright Institute의 동물 복지 및 윤리 검토 위원회(AWERB)의 승인을 받았습니다. 동물들은 사육된 동물의 사육 및 관리를 위한 실천 강령에 따라 수용되었습니다. 모든 절차는 프로젝트 라이선스 PPL70/8852에 따라 교육을 받고 유능한 개인 라이선스 보유자가 수행했습니다. 새끼 돼지는 ASPA에 따른 스케줄 1 방법에 따라 도태되었습니다.
1. 인서트 제조
- 제공된 3D 모델을 사용하여 3D 프린팅으로 인서트를 제작합니다(보충 파일 1).
참고: 3D 모델링을 사용하면 새로운 응용 분야에 맞게 설계를 쉽게 변경할 수 있습니다. 대체 재료 및 대체 제조 기술도 인서트를 생산하는 데 사용할 수 있습니다. 복잡한 내부 구조로 인해 선택적 레이저 소결 및 광조형이 적절한 대안입니다15. 폴리아미드 12(PA12, 재료 표 참조)는 액체 보유 및 반복적인 열 멸균 사이클에 대한 내성 측면에서 우수한 성능으로 인해 좋은 재료 후보입니다16. - 실리콘 개스킷과 폴리카보네이트 와셔를 레이저 절단17로 제작합니다., 보충 파일 2에 제공된 설계를 사용하여.
알림: 레이저 절단은 쉽게 아웃소싱할 수 있으며 저렴한 제조 방법입니다. 와셔는 스테인리스 스틸로 제조할 수 있어 반복 사용을 위한 더 저항력 있는 구성 요소를 제공합니다. 다른 모든 구성 요소는 상업적으로 이용 가능한 품목입니다. 필요한 재료의 전체 목록은 표 1에 나와 있습니다. 품목의 상업적 세부 사항은 재료 표에 포함되어 있습니다.
2. 장치 멸균, 조립 및 프라이밍
- 표 1의 지침에 따라 모든 구성 요소를 멸균하십시오.
- 층류 조건에서 그림 1A와 같이 두 개의 제작된 인서트를 조립합니다(1단계).
- 아래 단계에 따라 그림 2와 같이 관류 시스템을 조립합니다.
- 연결된 두 개의 3방향 밸브를 저장소의 R1 포트(매체 교환 포트)에 연결합니다.
- 단방향 밸브(단방향 밸브 튜브)가 장착된 튜브를 사용하여 결과 배출구를 연동 펌프의 헤드에 연결합니다.
- 단방향 밸브가 장착된 시스템 튜브를 사용하여 펌프 헤드를 반응 챔버의 C4 포트에 연결합니다.
알림: 이 분기에는 지속적인 모니터링이 가능한 압력 센서를 선택적으로 장착할 수 있습니다. - 반응 챔버 포트 C1을 부드러운 벽 튜브에 연결하고 이를 저항 채널(작은 내경)에 연결합니다.
알림: 저항 튜브의 길이는 시스템에 존재하는 압력에 큰 영향을 미칩니다. 적절한 관류 조건을 보장하기 위해 추가 조사를 해야 합니다. - 시스템 튜브로 저항 채널을 확장하여 리턴 채널을 만들고 R5의 저장소에 연결하여 루미널 순환 루프를 닫습니다(그림 2C).
- 시스템 튜브를 사용하여 반응 챔버 C3를 저장소 R3에 연결하여 오버플로 채널을 생성합니다.
- R2를 통해 환기 필터를 부착합니다.
- 공기와 매체가 들어 있는 주사기를 반응 챔버 C6에 연결하여 압력 댐퍼를 생성합니다.
알림: 올바른 공기 대 매체 비율은 필요한 압력 d에 따라 다릅니다.amp닝.
- 배지 교환 포트와 저장소를 통해 관류 배지(Dulbecco's modified eagle medium [DMEM] + 10% [v/v] 소 태아 혈청[FBS] + 1% [v/v] 페니실린-스트렙토마이신 + 1% [v/v] 암포테리신 B + 30% [v/v] 덱스트란, 재료 표 참조)로 시스템을 프라이밍합니다.
알림: 시스템을 프라이밍하면 시스템에 갇힌 기포의 위험이 줄어들고 잠재적인 누출을 식별할 수 있습니다. 배지의 권장 부피는 약 100-120mL입니다. 사용되는 부피는 실험에 사용되는 튜브의 데드 부피에 따라 다릅니다.
3. 시료 채취 및 준비
- 좌우 총경동맥을 채취하여 동맥 조직의 직접적인 취급을 최소화한다13.
- 조직을 저온 수송 매체(DMEM+ 20% [v/v] FBS + 2% [v/v] 페니실린-스트렙토마이신 + 1% [v/v] 암포테리신 B, 재료 표 참조)에 넣어 옮깁니다.
- 층류 캐비닛에서 과도한 결합 조직을 제거하고 메스 블레이드를 사용하여 조직의 끝을 다듬습니다. 차가운 운송 매체에서 티슈를 두 번 씻으십시오.
- 오비탈 셰이커에 조직을 올려 최소 30분 동안 운송 매체에 올려 놓고 깨끗이 씻습니다.
- 두 개의 가시가 있는 루어 커넥터를 사용하여 동맥의 비분지 부분을 생물 반응기 시스템에 연결하고 혈관 결합(혈관 실리콘 타이; 표 1).
알림: 용기 본드는 용기를 고정하기 위해 적절한 장력과 수축을 제공합니다. 타원형 섹션은 조직 손상을 방지합니다. - 개통을 확인하기 위해 동맥을 통해 배지를 부드럽게 흘려보냅니다.
- 제작된 삽입물에 동맥을 고정한 후 반응 공간을 관류 매체로 채웁니다(2.4단계). 마지막으로 루미널 순환 루프를 매체로 부드럽게 채워 시스템에 남아 있는 공기를 제거합니다.
- 반응 공간을 이전에 조립된 관류 시스템(섹션 2)과 연결하여 순환을 완료합니다.
NOTE: 처리된 조직의 면역조직화학에 의한 품질 검사를 수행하는 것이 좋습니다. 이것은 준비 중 과도한 취급으로 인한 손상을 식별합니다.
4. 관류 문화와 미디어 변화
- 관류 시스템을 37 % CO5가있는 2 °C 인큐베이터에 넣은 다음 연동 펌프에 연결합니다 (재료 표 참조)
- 압력 센서와 같은 추가(통성) 수집 시스템을 연결합니다( 재료 표 참조).
- 시스템을 ~10-15mL/분의 낮은 배지 유속으로 밤새 평형을 이루도록 둡니다.
알림: 펌프 설정, 매체 흐름, 시스템 압력 및 최적의 압력을 결정하기 위한 초기 실험amp적절한 조건이 충족되도록 하는 설정/clamps 설정이 필요합니다. - 다음 날, 최종 유속(35mL/분)에 도달할 때까지 유량을 점진적으로 증가시킵니다(매시간 +1rpm, 현재 시스템에서는 매시간 ~2.5mL/분 증가에 해당). 누출이 있는지 시스템을 주기적으로 모니터링하십시오.
알림: 연동 펌프 속도를 기반으로 정확한 유량을 계산하려면 사용자는 먼저 적절한 펌프 교정18을 수행해야 합니다. 공식 (1)을 사용하면 주어진 시간(t) 내에 분배된 부피(V)를 기준으로 체적 유량(Q)을 계산할 수 있습니다. 예상 유속()을 계산하기 위해 방정식 (2)에 설명된 이전에 계산된 유량(Q)과 용기 단면적(
A)을 사용할 수 있습니다.
(1)
(2) - 3일마다 새 배지로 채워진 주사기 하나를 펌프에 더 가까운 배지 교환 포트에 연결하고 빈 주사기를 저장소에 더 가까운 포트에 연결하여 배지의 50%(~50mL)를 교환하여 사용한 배지를 수집합니다(그림 2).
알림: 두 개의 3방향 밸브를 매체 교환 포트로 사용하면 매체 교환 중에 관류의 지속적인 작동이 용이합니다. - 실험이 끝나면 멸균 수술용 가위를 사용하여 생물 반응기에 연결된 끝을 잘라 반응 챔버에서 조직을 수확합니다.
- 나중에 사용할 수 있도록 시스템을 분해, 청소 및 멸균하십시오.
A)을 사용할 수 있습니다.
(1)
(2)5. 시료 분석
- 채취한 샘플을 4°C에서 밤새 4% 파라포름알데히드(PFA)에 고정합니다.
- 조직을 최적의 절단 온도(OCT, 재료 표 참조)19 에 매립하고 액체 질소로 냉각된 이소펜탄에 담가 동결합니다.
- 저온 유지 장치를 사용하여 3-5mm 두께의 극저온 절편을 얻습니다.
- 면역조직화학(헤마톡실린 및 에오신[H&E]) 및/또는 면역형광을 수행합니다. 일반적인 면역형광 프로토콜을 따르십시오.
- 인산염 완충 식염수(PBS, 재료 표 참조)에 20% [v/v] 염소 혈청을 사용하여 실온에서 1시간 동안 슬라이스를 차단합니다.
- PBS에서 1:50으로 희석된 CD31에 대한 1차 토끼 항체를 사용하여 4°C에서 밤새 절편을 배양합니다( 재료 표 참조).
- PBS로 5분 동안 세 번 씻습니다.
- PBS에서 1:200으로 희석한 형광 표지된 염소 항 토끼 2차 항체 및 PBS에서 1:200으로 희석한 α평활근 액틴(SMA) 직접 접합 형광 항체를 사용하여 37°C에서 1시간 동안 배양합니다( 재료 표 참조).
- PBS로 5분 동안 세 번 씻습니다.
- PBS에서 1:1,000으로 희석된 DAPI로 핵을 실온에서 10분 동안 염색합니다.
- 조직 자가형광을 줄이기 위해 실온에서 70%(v/v) 에탄올에 0.1%(w/v) Sudan Black( 재료 표 참조)을 10분 동안 배양합니다.
- 풍부한 탈이온수로 조직을 씻으십시오. 장착 매체에 슬라이드를 장착합니다.
- 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 샘플을 이미지화합니다.
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Representative Results
이 연구는 다재다능하고 저렴한 관류 시스템(EasyFlow)을 확립했습니다13. 시스템의 3D 프린팅 설계는 다른 실험실에서 시스템을 채택하는 것을 용이하게 하여 재현성을 촉진합니다.
제작된 관류 인서트는 50mL 원심분리 튜브에 보관되어 격리된 환경을 조성합니다. 두 개의 관류 삽입물을 사용하여 생물학적 시료를 배양하는 저장소와 반응 챔버를 포함하는 관류 루프를 설정할 수 있습니다. 그런 다음 관류 시스템을 연동 펌프와 압력 센서 및 초음파 장치와 같은 선택적 획득 시스템에 연결하여 배양 조건을 모니터링합니다(그림 2).
돼지 경동맥 샘플을 채취하여 7일 동안 관류하여 배양하기 전에 처리하였다. 배양 전 조직의 품질을 보장하기 위해 절제 시, 조직 준비 후 및 관류 후 샘플을 고정하는 예비 실험을 수행했습니다. 내피(CD31) 및 평활근(αSMA) 마커에 대한 형광 염색을 사용하여 조직 무결성의 유지를 평가했습니다. 잘 보존된 조직과 손상된 조직의 예가 비교를 위해 그림 3 에 나와 있습니다. 이 이미지는 잘못된 처리(과도한 스트레칭, 파쇄 등)로 인해 배양 전에 내피가 손실될 수 있으므로 절제 시 조직을 부드럽게 다루는 것이 중요하다는 것을 보여줍니다. 결과는 또한 내강 손상을 피하기 위해 관류를 점진적으로 설정하는 것의 중요성을 보여줍니다.
H&E 염색은 면역형광(IF) 염색과 함께 수행되어 배양 7일 후 혈관 벽에서 세포의 형태 및 전체 분포 유지를 보여주었습니다(그림 4). 장치에 생리학적 배양 조건을 적용하면 내강의 내피 피복 범위 유지, 배지에서 평활근 세포의 정렬 및 외막에서 혈관 혈관의 보존이 보장됩니다.
바이오리액터 시스템의 컴팩트한 모듈식 설계는 또한 광범위한 시스템 설정을 가능하게 합니다. 더 작은 설정은 단일 바이오리액터로 구성되며 약리학 및 소량 연구(재순환 관류20, 총 부피 50-70mL)에 이상적입니다. 배양 길이를 늘리고 배지 교체 횟수를 줄이려면 이 프로토콜에 설명된 것과 같은 단일 저장소 순환 시스템 또는 순환 중인 배지의 양이 더 많기 때문에 일정한 공급 시스템이 더 이상적입니다. 자극의 국소화가 중요한 실험 설정을 탐색하기 위해 이중 순환21 설정을 설정할 수 있습니다. 또한 현재 장치를 보다 정교한 제어 시스템과 결합하여 pH 및 용존 산소와 같은 파라미터에 대한 정밀한 피드백 제어를 가능하게 할 수 있습니다(그림 5).
그림 1: EasyFlow 어셈블리 회로도. (A) 관류 삽입물의 조립을 지원하는 3D 렌더링 회로도. (B) 연결 부위의 조립을 용이하게 하기 위해 상세한 회로도가 제공됩니다. (C) 반응 공간의 단면도는 EasyFlow 인서트의 필수 구성 요소와 인서트에 대한 조직의 연결을 강조합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 관류 시스템 어셈블리의 개략도. (A) 모든 중요한 구성 요소를 포함하는 조립된 관류 시스템으로, 3D 렌더링 환경에서 상대적 위치를 강조합니다. 모든 구성 요소가 확장되는 것은 아닙니다. (B) 구성 요소의 개별 등각 투영 보기도 제공됩니다. (C) 조립된 관류 시스템의 평면도는 서로 다른 구성 요소의 조립 및 연결을 돕기 위해 표시됩니다. 포트에는 관류 시스템 전체의 다양한 연결 사이트를 탐색하기 위해 시계 반대 방향으로 레이블이 지정되고 번호가 매겨져 있습니다. 이 원리는 저장소(R)와 반응 챔버(C)에 적용되었습니다. 두 챔버를 연결하는 다양한 채널에도 참조용으로 이름이 지정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 처리 중 조직 유지 관리. (A) 컨포칼 이미지는 수확 당시, (B) 세척 및 처리 후, (C) 관류 배양 후의 동맥의 정상적인 구조를 보여주며, 잘 보존된 형태가 유지됨을 보여줍니다. (D) 처리 중 과도하거나 잘못된 취급으로 인한 손상된 조직의 예 또는 (E) 비생리학적 배양 조건의 적용(즉, 고유량의 갑작스러운 시작)으로 인한 조직 손상은 발광 커버리지의 고갈 및 배지의 중단을 보여줍니다. (F) 음성 대조군은 염색의 특이성을 나타냅니다. CD31: 녹색; αSMA: 빨간색; DAPI: 파란색. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 관류 배양 전후 조직의 조직학적 평가. (A 및 B) 동맥 조직은 생물반응기 시스템으로 배양한 후 수확 시 및 (C 및 D)에 조직학에 의해 평가하였다. (A 및 C) H&E 염색은 동맥벽 구조와 조직의 보존을 보여줍니다. (B 및 D) 동일한 조직의 면역형광 염색은 내피 피복, 평활근 세포 정렬 및 외래의 혈관 혈관을 증명합니다. CD31: 녹색; SMA: 빨간색; DAPI: 파란색. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 가능한 관류 설정의 개략도 . 관류 삽입물과 함께 다양한 대체 설정을 수용하여 다양한 실험 연구를 수행할 수 있습니다. (A) 재순환 관류 설정은 필요한 매체의 부피를 최소화합니다. (B) 일정한 공급 설정은 조직에 배지를 안정적으로 공급합니다. (C) 단일 저장소 순환(이 논문에 설명된 대로)은 장기 배양을 위해 더 많은 양의 배지를 제공하고 공기 교환 및 압력 평형을 위한 완충 영역을 포함합니다. (D) 이중 순환 설정은 내부(동맥 내부) 및 외부(반응 공간) 순환에 독립적으로 공급되는 두 개의 고유한 루프를 제공합니다. (E) 동적 관류 설정에는 연속 가스 및 비례 적분 유도체(PID) 컨트롤러에 의한 pH 제어가 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 인서트 제작을 위한 구성 요소. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 3D 프린팅 제조용 EasyFlow 인서트의 3D 모델. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: 구성된 장치, 단면도, 인쇄물 및 밀봉 구성 요소의 설계 회로도. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
생체 외 혈관 관류 시스템은 통제된 조건 하에서 본래 조직 내에서 혈관 세포의 기능과 거동을 연구하는 고유한 플랫폼을 구성하며, 이를 통해 부상 후 혈관 리모델링과 같은 복잡한 과정을 해부할 수 있습니다22. 그러나, 보고된 대부분의 생물반응기는 맞춤형의 구성요소를 기반으로 하는 자체 제작 시스템이며, 종종 다른 사람들에 의해 복제되기 어렵다23. 대체 상용 솔루션이 존재하지만 설계의 유연성이 부족하고 상대적으로 비용이 많이 들 수 있습니다24.
우리는 오픈 소스 3D 프린팅 기술을 사용하여 제조할 수 있는 쉽고 저렴하며 재현 가능한 플랫폼을 제공하는 대체 시스템을 개발했습니다13. 이 문서에서는 최종 사용자가 재현 가능한 응용 프로그램을 사용할 수 있도록 하는 시스템 설정에 대해 설명합니다. 이 설정을 통해 압력(40-180mmHg), 유속(6-30mL/분) 및 다양한 정도의 전단 응력으로 혈액 점도를 모방하는 매체와 함께 생리학적 및 병리학적 조건을 적용할 수 있습니다.
재현성은 연구자들이 다른 사람들의 발견을 검증하고 이를 바탕으로 혈관 질환에 대한 이해를 발전시킬 수 있도록 하기 때문에 과학적 과정의 필수적인 측면입니다. 또한 그룹 간의 협업을 가능하게 하고 촉진하는 도구는 과학 지식을 발전시키는 데 필수적입니다. EasyFlow는 혈관 과학 분야 및 그 밖의 분야에서 광범위한 프로젝트를 수행하는 실험실에서 쉽게 생산하고 채택할 수 있는 오픈 소스 액세스 솔루션의 한 예입니다.
이 장치 배양은 최소 7일 동안 동맥 조직 생존력을 유지하며 혈관 질환의 특정 단계를 모델링하는 데 사용할 수 있습니다. 이를 사용하여 생리적 유량 및 압력 조건을 모델링할 수 있습니다13. 중요한 것은 이 관류 배양이 낮은 생산 비용과 시스템 작동에 필요한 적은 양의 배지로 인해 비용 효율적이라는 것입니다.
3D 설계는 새로운 응용 분야에도 적용할 수 있으며 프린팅을 위한 새로운 재료를 테스트할 수 있습니다. 현재 형식에서도 샘플 수용 공간은 피팅의 길이 또는 루어 커넥터의 보어를 변경하여 다양한 크기의 샘플에 쉽게 적용할 수 있습니다. 장치의 모듈식 특성과 작은 크기를 감안할 때 이 바이오리액터는 여러 설정에서 사용할 수 있으며(그림 5) 별도의 바이오리액터에서 여러 샘플을 동시에 다른 조건에 노출할 수 있는 멀티플렉스 배양에 적용할 수 있다는 점에 유의해야 합니다.
이 시스템의 사용은 상이한 기원(예를 들어, 상이한 종) 및 상이한 성질(예를 들어, 정맥, 림프관)의 혈관 배양을 지원하기 위해 미래에 확대될 것으로 예상되며, 아마도 다른 중공 조직(예를 들어, 기관, 장)의 배양에 적용될 수 있을 것이다. 특히, 연구에 따르면 조직-공학된 스캐폴드를 일정한 관류로 배양하는 것은 생성된 조직25,26의 구성 및 성숙 내에서 세포의 균질한 분포를 돕는다. 또한, 관류에서 혈관 이식편을 파종하는 것은 정적 방법에 비해 보다 균일하게 세포화된 혈관 내강을 달성하는 데 기여한다27. 이러한 이유로, 우리는 현재의 문제를 해결하는 데 도움이 되도록 시스템을 조직 공학에 적용하여 재현 가능한 합성 혈관 대체물28의 미래 개발을 가능하게 할 것으로 예상합니다.
여기에 설명된 프로토콜은 유동 문화권의 성공에 중요한 몇 가지 중요한 단계를 제시합니다. 적절한 유동 조건을 설정하고 모니터링하는 것은 간단하지 않으며 배양 조건이 생리학적인지 확인하기 위해 처음 설정할 때 각 시스템에서 수행해야 합니다. 유량과 압력은 압력 센서와 초음파 영상을 사용하여 모니터링되었습니다. 또 다른 중요한 점은 배양 초기에 조직이 생존 가능하고 손상되지 않았는지 확인하는 것입니다. 이를 위해서는 신선한 공급원과 신중한 취급이 필요하며 조직학적 분석을 통해 확인할 수 있습니다. 또한 잠재적인 박테리아 오염 또는 매체 누출 원인을 식별하기 위해 모든 실험을 시작할 때 문제 해결을 수행해야 합니다.
설명된 관류 시스템은 생리학적 압력 및 흐름 조건을 제공하지만 생체 내에서 기록된 복잡한 압력파 패턴을 완전히 모방할 수 없다는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 이러한 한계는 연동 펌프를 사용하는 데 기인하며, 고급 혈류역학적 조건을 재현하기 위해 보다 전문화된 장비를 사용하여 해결할 수 있습니다. 생물반응기의 혈관 배양은 면역 체계 또는 다른 장기와의 상호 작용이 중요한 연구에서도 해결할 수 없습니다.
결론적으로 생리적 혈류역학적 환경을 모방할 수 있는 간단한 3D 프린팅 관류 시스템을 제시하여 체외 혈관 배양 표준화에 기여할 것으로 기대된다. 맞춤화 및 장기 배양에 대한 적용 가능성은 생리학 및 병리학적 조건에서 이러한 복잡한 생물학적 시스템에 대한 이해를 증진하는 데 필수적인 도구입니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 조직학 서비스에 대해 University of Surrey School of Veterinary Medicine의 Veterinary Pathology Center에 감사의 뜻을 전합니다. 또한 동물 조직 조달을 지원해 준 The Pirbright Institute(영국 Pirbright)의 L. Dixon, A. Reis, M. Henstock 박사와 Surrey 대학의 생화학 과학과, 특히 기술 팀의 지속적인 지원에 감사드립니다. RSM은 박사 과정 대학 학생상(University of Surrey)의 지원을 받았고, DM과 PC는 National Centre for the Replacement, Refinement & Reduction of Animals in Research(보조금 번호: NC/R001006/1 및 NC/T001216/1)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasyFlow | - | - | 3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs |
| PA12 - 3D printing | Protolabs | - | - |
| Peristaltic pump | Heidolph | PD5201 | |
| Culture media components: | |||
| Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water | Sigma-Aldrich | A2942-20ML | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8802-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Immunostaining materials: | |||
| Cryostat | LEICA | CM3050 S | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Invitrogen eBioscience Fluoromount G | Thermo Fisher Scientific | 50-187-88 | |
| MX35 Premier + Microtome Blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| Optimal Cooling Tempearure Compound - OCT | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Rabbit α-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Sudan Black B | Santa Cruz Biotechnology | SC-203760 | |
| X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box | Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody | R&D Systems | IC1420R | |
| Material for laser cutting of components: | |||
| Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of washers) | RS Components | 258-6590 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Optional pressure monitors: | |||
| Pressure sensor | Parker Hannifin | 080-699PSX-3P-5 | |
| SciPres Pressure Monitor | Parker Hannifin | 206-200-M | |
| Pre-sterilized single use plasticware: | |||
| 0.2 um filter | Sarstedt | 70.1114.210 | |
| 20 mL Sterile syringe | IMS Euro | 40004 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | Sarstedt - 62.547.254 | |
| Small components: | |||
| Cable ties | - | - | |
| Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb | Cole-Parmer | WZ-30800-10 | Barb Adaptor |
| Masterflex Polycarbonate Luer Fittings | Cole-Parmer | AU-45504-84 | |
| Nylon Miniature Check Valve | Cole-Parmer | 98553-00 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Stainless Steel M2 Hex Nuts | RS Components | 527-218 | |
| Stainless Steel M2 x 6 mm Screws | RS Components | 418-7426 | |
| Stainless Steel M5 Hex Nuts | RS Components | 189-585 | |
| Surgical vessel loop | Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies | 10-1003 | |
| Three-way valves | IMS Euro | 91000 | |
| Surgical Equipment | |||
| Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07 | International Medical Supplies | SKU: BD-07 | |
| Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm | International Medical Supplies | SKU: BD-361 | |
| Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm | International Medical Supplies | SKU: FD-12 | |
| Troge Surgical Scalpels - Size 23 - Box of 100 | International Medical Supplies | 63114 | |
| Tubing: | |||
| Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm) | Eppendorf | M0740-2396 | System tubing |
| Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing | ISMATEC | 95714-48 | Soft wall tubing (for clamp) |
| RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone | RS Components | 667-8432 | Resistance tubing (small inner diameter) |
| Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm) | Heidolph | 525-30027-00-0 | One way valve tube |
| Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene | RS Components | 125-4042 | Pump Tubing |
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