Summary
检查点抑制剂是开发抗癌疗法的重要靶点。本报告介绍了一种新型基于 PDL1 肽的癌症疫苗 PDL1-Vaxx，它诱导中和多克隆抗体的产生，从而阻断 PD-1/PDL1 复合物的形成。这项工作还详细介绍了用于分析这种活性的基于荧光珠的测定法的开发和测试。
Abstract
用单克隆抗体抑制检查点受体（PD-1、PD-L1 和 CTLA-4）在治疗癌症患者的临床试验中显示出极大的益处，并已成为现代癌症免疫治疗的主要方法。然而，只有一部分患者对检查点单克隆抗体免疫治疗有反应。因此，开发新的癌症治疗策略是当务之急。已经开发出一种新型 B 细胞肽表位 PDL1（程序性死亡配体 1）癌症疫苗，氨基酸 130-147 通过 GPSL 连接子与 MVF 肽（“混杂”T 细胞麻疹病毒融合蛋白）连接。临床前测试表明，这种PDL1疫苗（PDL1-Vaxx）可有效刺激动物体内的高免疫原性抗体。用 PDL1-Vaxx 免疫的动物在各种动物癌症模型中显示出肿瘤负荷降低和存活率延长。作用机制表明，疫苗引发的抗体抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，并阻断PD-1/PD-L1相互作用。本文介绍了一种基于磁珠的检测方法，该检测方法使用双报告分子流分析系统来评估 PD-1/PD-L1 相互作用及其被针对 PDL1-Vaxx 的抗 PDL1 抗体阻断。
Introduction
在免疫系统的 T 细胞、B 细胞和细胞内检查点中，信号通路调节免疫活动。一些癌细胞通过刺激检查点靶点来保护自己免受免疫攻击，从而抑制免疫功能并促进肿瘤存活和增殖。通过检查点抑制的肿瘤免疫疗法使用抗体来靶向和阻断信号检查点，从而恢复免疫系统的抗肿瘤功能 1,2,3。目前有效的抗癌疗法包括靶向程序性死亡蛋白 1 （PD-1）4 的单克隆抗体 nivolumab 和靶向程序性死亡配体 1 （PD-L1）5 的阿替利珠单抗。这种方法在治疗癌症患者方面取得了巨大的临床成功。然而，不良事件和治疗耐药性减轻了当前检查点抑制策略的临床效用，尤其是在单药治疗中6。在癌症治疗中，迫切需要免疫疗法和更有效的低毒性治疗策略的结合1,3,6。
在过去的 30 年里，Kaumaya 博士的实验室开发了用于癌症治疗的肽癌疫苗和肽模拟物相关药物，其中一些正在进行临床试验 1,2,7,8,9,10,11,12,13,14 .例如，B-Vaxx 与 HER-2 联合免疫疗法在临床试验中显示出对转移性和/或复发性实体瘤的益处12.该实验室最新的癌症疫苗是PD1-Vaxx 2,13和PDL1-Vaxx14，它们在临床前研究中显示出巨大的优势，特别是在联合治疗方面。PD1-Vaxx已在美国和澳大利亚完成了剂量递增临床试验。PD1-Vaxx 将在 2023 年 5 月开始的 1b 期试验中与阿替利珠单抗联合使用。本报告重点评估 PDL1-Vaxx 诱导的抗体阻断 PD-1/PD-L1 相互作用的能力。
PDL1-Vaxx 癌症疫苗是一种新型 B 细胞肽表位疫苗，其中 PD-L1 氨基酸 130-147 通过 GPSL 肽连接子与混杂 T 细胞麻疹病毒融合 （MVF） 肽相连。临床前研究表明，PDL1-Vaxx 在刺激各种动物模型中产生抗癌抗体、延长生存期并减轻肿瘤负荷方面具有高度免疫原性14。这些针对 PD-L1 肽产生的抗体可以成功阻断 PD1/PD-L1 相互作用，从而产生抗肿瘤活性。本报告介绍了一种检测方法，该检测方法使用基于磁珠的格式和 流式细胞术仪器上的双报告基因读数来分析 PDL1-Vaxx 诱导的抗体对 PD1/PD-L1 复合物形成的阻断。
Protocol
1.实验准备
注意：此步骤中提到的所有试剂/设备的详细信息都列在 材料表中。
- 获得重组人PD-1（rhPD-1;多聚组氨酸标记）。使用前用无菌过滤的磷酸盐缓冲盐水 （PBS）（pH 7.4）复溶冻干的 rhPD1。
- 获得生物素化的重组人PD-L1（rhPD-L1）。使用前用无菌去离子水复溶冻干的rhPD-L1。
- 获得链霉亲和素偶联的 R-藻红蛋白检测试剂 （SAPE）。将所有SAPE溶液存放在冰箱温度（即2-8°C）下避光保存。
- 获得荧光染色的磁性微球（直径6.5μm，带有嵌入磁铁矿的聚苯乙烯）和珠偶联套件15 （如果使用，请参阅 材料表）。与微球的共价偶联需要磺基-NHS（磺基-N-氢化琥珀酰亚胺）和EDC（N-[3-二甲氨基丙基]-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐）。
注意：磁珠组可提供 500 个独特的荧光标签中的任何一个，这允许从不同的珠组16 中识别和区分。微珠的储备浓度为 2.5 × 106 个微珠/mL 和 12.5 × 106 个微珠/mL。将珠子存放在冰箱温度（即 2-8 °C）避光保存。不要冷冻珠子悬浮液。 - 获得阳性和阴性对照抗体以及 Brilliant Violet 421 （BV421） 标记的二抗。储存所有防光的荧光偶联分子。
- 在低蛋白结合管中进行所有偶联反应，在低蛋白结合、圆底、96 孔微量滴定板中进行所有测定反应。用一次性粘性箔或塑料 96 孔微孔板盖密封板，用于测定孵育步骤。在测定洗涤步骤中，使用磁性板分离器固定磁珠。
注：双报告流分析系统有三个激光器：（1）一个用于识别和量化珠组特异性荧光（分类通道）;（2）检测和量化靶标特异性藻红蛋白（PE）荧光（报告通道1;532 nm激发，“橙色”565-585 nm发射）;（3）检测和定量第二靶标分析物的靶标特异性BV421荧光（报告通道2;405 nm激发，“蓝色”421-441 nm发射）。
2. 将rhPD-1偶联到磁珠上
注意：要偶联的蛋白质必须不含牛血清白蛋白 （BSA）、叠氮化钠、甘氨酸、甘油、三（羟甲基）氨基甲烷 （Tris） 或含胺添加剂，并且应悬浮在 pH 值为 7.4 的 PBS 中。市售偶联试剂盒包括本文所述的所有必要试剂和缓冲液（参见 材料表）。
- 从冰箱中取出所有偶联试剂，让它们平衡至室温（室温，18-22°C）20-30分钟。
- 根据产品信息表，通过短暂的涡旋、超声处理或旋转（15-15 rpm 下 15 分钟）重悬储备微球。
- 将 1 × 10 6个磁珠 转移到 1.5 mL 低蛋白结合微量离心管中（参见 材料表）。
- 用 100 μL 活化缓冲液15：0.1 M NaH2PO4 （二碱性），pH 6.2 洗涤珠子。
注：偶联也可使用预配置的偶联试剂盒进行偶联，该试剂盒包括 0.1 M 2-吗啉基乙磺酸 （MES），pH 6.0，作为替代活化和偶联缓冲液（参见 材料表）。- 将含有珠子的试管放入磁力分离器中1-2分钟。
注意：或者，可以通过在 ≥8,000 × g 下微量离心 1-2 分钟来分离珠子。 - 用移液管从磁铁固定或颗粒状的珠子中吸出上清液，管子仍位于磁选机中。
- 从磁铁中取出微量离心管，并加入 80 μL 偶联缓冲液（参见 材料表）。
- 轻轻涡旋反应管，超声处理20秒以分散珠子。
- 将含有珠子的试管放入磁力分离器中1-2分钟。
- 用sulfo-NHS和EDC激活珠子。
注：磺基-NHS的储备溶液为50mg / mL，溶于活化缓冲液中。EDC储备溶液也溶解在活化缓冲液中50 mg/mL。活化缓冲液和大气中的水分都会导致EDC降解。不建议使用存储的 EDC 解决方案。在步骤之前制作足够的新鲜EDC溶液，并在溶液准备好后立即使用。丢弃多余的EDC溶液。
注意：EDC会引起严重的眼睛刺激，是对呼吸道和皮肤的刺激。- 将 10 μL 磺基 NHS 加入含有洗涤和活化珠子的微量离心管中。
- 向含有珠子和磺基-NHS的微量离心管中加入10μLEDC储备溶液。
- 保护光敏微球免受光照，并在室温（18-22°C）下以15-30rpm在旋转器上旋转20分钟。或者，如果轻轻涡旋以每隔 10 分钟重新分配珠子，则管可以在活化步骤中保持静止。
- 从珠子上洗掉多余的偶联试剂。
- 将含有活化珠的试管置于磁性分离器中1-2分钟。
- 用移液管从磁铁固定或沉淀的珠子中吸出上清液，管仍位于磁性分离器中。
- 从磁铁中取出微量离心管，并加入 100 μL 活化缓冲液。
- 轻轻涡旋反应管以分散珠子。
- 重复步骤 2.6.1-2.6.4 两次，总共洗涤三次。洗涤结束时，将珠子悬浮在 100 μL 活化缓冲液中，浓度约为 10 ×10 6 个珠子/mL。
- 将 rhPD-1 肽偶联到活化的珠子上。
- 向含有活化珠的试管中加入 390 μL 活化缓冲液，使总珠悬浮液体积达到 490 μL。
- 通过向含有活化珠的试管中加入 10 μL PD-1 肽溶液（1 mg/mL 溶解在 PBS 中），将 1 μg PD-1 肽加入活化珠悬浮液中。
- 短暂涡旋微量离心管，使PD-1和活化的珠子均匀分布。
- 在室温（18-22°C）下，将珠子与PD-1在黑暗中孵育2小时，旋转（15-30rpm）。
- 使用测定/洗涤缓冲液（PBS-TBN：1x PBS，pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05% 吐温-20 + 0.05% NaN315）洗涤珠子两次（2x）。
- 将含有活化珠的试管置于磁性分离器中1-2分钟。
- 用移液管从磁铁固定或颗粒状的珠子中吸出上清液，管子仍位于磁选机中。
- 从磁铁中取出微量离心管，并加入 100 μL 活化缓冲液。
- 轻轻涡旋反应管以分散珠子。
- 重复步骤 2.8.1-2.8.4 一次，总共洗涤两次。洗涤结束时，将珠子悬浮在 100 μL 活化缓冲液中，浓度为 10 ×10 6 个珠子/mL。
注意：如果缓冲液不用作储存介质，则可以在不使用叠氮化钠（防腐剂）的情况下制备测定/洗涤缓冲液。 - 如果不立即使用，请将rhPD-1偶联珠在2-8°C的冰箱中避光储存。蛋白偶联微珠可稳定保存长达 18 个月。
3. rhPD-1与磁珠成功偶联的评估
注：rhPD-1偶联的微球与生物素化的rhPD-L1反应，后者通过与SAPE孵育进行检测，然后在流式细胞仪上进行评估。这验证了 PD-1 与磁珠的成功偶联以及 rhPD-1 和 rhPD-L1 蛋白之间的功能相互作用。
- 在 PBS-TBN 中创建生物素化 rhPD-L1 的两倍连续稀释系列（储备 rhPD-L1 溶液为 1 mg/mL）。要测试的最终 rhPD-L1 浓度范围为 8 μg/mL 溶液至 313 pg/mL 溶液。每个 rhPD-L1 稀释液的体积为 150 μL：每个反应 50 μL，每个条件两个反应，加上足够的过量以适应移液损失。
- 将rhPD-L1稀释微量离心管标记为8μg/ mL，4μg/ mL，2μg/ mL，1μg/ mL，0.5μg/ mL，0.25μg/ mL，0.125μg/ mL，0.063μg/ mL和0.031μg/ mL。0 μg/mL 试管（仅限 PBS-TBN）用作无 PD-L1 对照。
- 将 150 μL PBS-TBN 预加载到所有标记的 rhPD-L1 稀释管中。
注意：要测试的最高最终 rhPD-L1 浓度为 8 μg/mL，将 rhPD-L1 加入反应混合物后按 1：1 稀释，因此标有“8 μg/mL”的稀释管是指最终浓度，实际含有 16 μg/mL rhPD-L1。所有稀释管上的标签表示加入反应后的最终rhPD-L1浓度。 - 产生最高浓度的 rhPD-L1 稀释液（实际 16 μg/mL）。这是 1 mg/mL rhPD-L1 储备溶液 （1,000 μg/16 μg = 62.5） 的两步法 62.5 倍稀释。
- 将 84 μL PBS-TBN 与 16 μL rhPD-L1 储备溶液（1 mg/mL，即 1,000 μL）在微量离心管中混合。这是 6.25 倍稀释，所得浓度为 160 μg/mL rhPD-L1。
- 在标有“8 μg/mL”的试管中，将 270 μL PBS-TBN 与上一步中产生的 30 μL rhPD-L1 稀释液 （160 μg/mL） 混合。这是 10 倍稀释，所得浓度实际上是 16 μg/mL。“8 μg/mL”试管标签是指其加入反应后的最终浓度。
- 将步骤 3.1.3 中产生的 150 μL rhPD-L1 稀释液（“8 μg/mL”）转移到“4 μg/mL”管中，关闭微量离心管盖，并短暂涡旋以混合溶液。
- 依次重复步骤3.1.4，直到rhPD-L1稀释系列完成。创建后，所有介于“8 μg/mL”至“0.063 μg/mL”之间的试管以及 0 μg/mL 对照应含有 150 μL 溶液，最后一个试管“0.031 μg/mL”应含有 300 μL 溶液。这样可以产生足够体积的每种稀释液，以在重复反应中测试每种生物素化 rhPD-L1 稀释液的 50 μL，剩余的剩余量足以容纳移液损失。
- 使用血细胞计数器计数rhPD-1偶联珠17。
- 将储备的 rhPD-1 偶联微珠稀释至 5 × 10个 4 个微珠/mL，体积足以满足 2,500 个微珠/50 μL/反应。
- 涡旋 5 × 10 个4 个珠子/mL rhPD-1 偶联微珠悬浮液，并将 50 μL 悬浮液移液到 96 孔圆底微量滴定板的每个标记/映射孔中，以便为正在测试的每个 rhPD-L1 稀释液创建重复孔。
- 将步骤 3.1 中创建的每个生物素化 rhPD-L1 稀释管的 50 μL 加入微量滴定板上的相应孔中。
- 用一次性箔或塑料粘合板密封剂覆盖微量滴定板，并在轨道振荡器（600rpm）上在室温（18-22°C）下在黑暗中孵育板1小时。
- 从珠子中洗涤多余的生物素化rhPD-L1。
- 将密封板从轨道振荡器转移到磁性板分离器2分钟以固定珠子。
- 小心地取下粘性板密封剂，确认磁铁和微量滴定板牢固地结合在一起，并酌情将板倒置并将上清液倒入水槽或生物危害液体废物容器中。轻轻但轻快地将倒置的板敲击到吸水纸巾的垫子上，以去除剩余的上清液。
- 从磁性板分离器中取出微量滴定板，将 150 μL PBS-TBN 移液到每个孔中。
- 将未密封的板放在磁选机上2分钟以固定珠子。
- 确认磁铁和微量滴定板牢固地结合在一起，并酌情倒置板并将上清液倒入水槽或生物危害液体废物容器中。轻轻但轻快地将倒置的板敲击到吸水纸巾的垫子上，以去除剩余的上清液。
- 重复洗板步骤3.7.3-3.7.5两次，总共三次洗涤，每次洗涤150μL PBS-TBN。确保在最后一个洗涤步骤结束时没有上清液残留在孔中。稳定地工作，以防止固定珠子在井底干燥。
- 添加SAPE检测试剂。
- 将 PBS-TBN 中的 SAPE 储备溶液稀释至 6 μg/mL 的工作浓度。准备足够的SAPE工作溶液体积，以便所有反应孔都可以接受100 μL/孔，并有足够的额外容量来适应移液损失。
- 从磁性板分离器上取下微量滴定板。
- 向每个反应孔中加入100μLSAPE工作溶液，并通过移液重悬洗涤的珠子。
- 用箔或塑料粘合板密封剂密封96孔微量滴定板，并在室温（18-22°C）下在600rpm的轨道振荡器上在黑暗中孵育1小时。
- 从培养箱中取出微量滴定板，将其转移到磁性板分离器中以固定珠子，取下粘合板密封剂，并用150μLPBS-TBN洗涤珠子三次，如步骤3.7.3-3.7.5所述。
- 去除最终洗涤液后，从磁性板分离器中取出板，并将珠子重悬于每孔 100 μL PBS-TBN 中。
- 分析结果。
- 读取流式分析仪器上的板（参见 材料表），使用以下仪器设置确定每个反应的中值荧光强度（MFI）：吸液体积= 50μL;最小磁珠数 = 100 颗磁珠;超时设置 = 40 秒;门控 = 7,000-17,000;操作模式 = Single Reporter。为每个条件运行重复的孔，并在执行进一步的数据计算和绘图之前对每个条件的两个输出MFI值进行平均。
注：每个稀释液的MFI值应显示浓度依赖性结合，表明可接受的rhPD-1偶联效率与微珠，并确认重组PD-1 / PD-L1蛋白的良好相互作用。
- 读取流式分析仪器上的板（参见 材料表），使用以下仪器设置确定每个反应的中值荧光强度（MFI）：吸液体积= 50μL;最小磁珠数 = 100 颗磁珠;超时设置 = 40 秒;门控 = 7,000-17,000;操作模式 = Single Reporter。为每个条件运行重复的孔，并在执行进一步的数据计算和绘图之前对每个条件的两个输出MFI值进行平均。
4. PD-L1磁珠PD-1/PD-L1封闭试验
注：该测定评估可溶性介质（例如，抗 PDL1 肽抗体）对重组 PD1/PD-L1 相互作用的阻断活性。简而言之，生物素化的 rhPD-L1 与不同 PDL1-Vaxx 肽接种后在兔中产生的抗体预孵育。然后使用 rhPD-1 偶联磁珠捕获 rhPD-L1 + 抗 PDL1 抗体混合物，并通过添加链霉亲和素-PE 来定量 rhPD-L1 与 rhPD-1 偶联磁珠的结合。PE 荧光信号与测试的抗 PDL1 抗体/抑制剂的阻断活性呈负相关。通过结合 BV421 偶联的抗兔（用于抗 PDL1 肽抗体）或抗人（用于对照抗体）二抗以及评估仪器第二通道中的 BV421 荧光，同时评估抗 PDL1 肽抗体结合。测定步骤如 图1所示。
- 制备两倍连续稀释系列测试抗体，包括 PDL1-Vaxx 诱导的多克隆候选抗体、阴性对照抗体（曲妥珠单抗、赫赛汀、人源化抗 HER2 单克隆抗体）和阳性对照抗体（阿替利珠单抗;人源化抗 PDL1 IgG1 单克隆抗体）。每次反应将使用 25 μL 指定的抗体稀释液，因此所示体积足以在每个条件下的重复孔中执行每个反应（即每个条件 50 μL），剩余一些多余的溶液以适应移液损失。
- 对于每种疫苗诱导的抗 PDL1 肽抗体和对照抗体，确保测试的最终抗体浓度范围为 1,000 μg/mL 至 8 μg/mL。制备 2,000 μg/mL 所有抗体的储备溶液。
- 对于每种抗体，将稀释管标记为 1,000 μg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、63 μg/mL、31 μg/mL、16 μg/mL 和 8 μg/mL，并包括抗体名称。对于每种抗体，还要添加一个“0 μg/mL”管，该试管将作为仅载体 （PBS-TBN） 对照。
注意：当加入反应混合物中时，抗体浓度将按 1：1 稀释。抗体稀释管被标记为加入反应后的 最终 抗体浓度，实际上含有比标记的抗体量两倍的抗体。 - 将 75 μL PBS-TBN 加入所有标有“500 μg/mL”及以下的抗体稀释管中，包括“0 μg/mL”载体专用对照管。
- 对于每种抗体，将 150 μL 的 2,000 μg/mL 储备溶液移液到标有“1,000 μg/mL”的相应管中。这将用于对每种抗体进行所有后续稀释。
- 对于每种抗体，通过将 75 μL 从“1,000 μg/mL”管转移到具有该系列中下一个较低稀释度（即“500 μg/mL”）的试管中，创建一个完整的稀释系列。关闭新完成的稀释管，短暂涡旋，通过将 75 μL 从“500 μg/mL”管转移到“250 μg/mL”管继续构建稀释系列。重复此模式，直到所有抗体的最后一次稀释“8 μg/mL”。
注：在每种抗体的完整稀释系列中，除最低稀释度 8 μg/mL 外，所有试管的体积应为 75 μL，其体积应为 150 μL。每个反应将使用 25 μL 抗体稀释液，因此这些体积足以在每个条件下的重复孔中执行每个反应（即每个条件 50 μL），并额外用于适应移液损失。
- 将 25 μL 稀释的抗体放入 96 孔微量滴定板的指定孔中。
- 在PBS-TBN中将生物素化的rhPD-L1稀释至工作浓度为4μg/mL，其体积足以在每个条件下的重复孔中包括25 μL（即每个条件50 μL），并增加以适应移液损失。
注：在这项工作中，4 μg/mL 的生物素化 rhPD-L1 产生了早期偶联评估中测量的最大 MFI 信号的约 50%，并用于 PD-1/PD-L1 阻断分析。 - 向每个反应孔中加入25μL生物素化rhPD-L1（4μg/ mL），用箔或塑料粘合剂密封覆盖微量滴定板，并在室温（18-22°C）下孵育1小时，在轨道板振荡器上以600rpm振荡。
- 将 rhPD-1 偶联磁珠稀释至 50,000 个磁珠/mL，并有足够的体积容纳 50 μL/孔（2,500 个磁珠/孔）以及额外的体积以适应移液损失。
- 从振荡器中取出 96 孔微量滴定反应板，并取下粘合板密封。
- 向每个孔中加入 50 μL rhPD-1 偶联微球混合物。
- 密封板，并在室温（18-22°C）下在600rpm的轨道振荡器上在黑暗中孵育1小时。
- 将密封板从轨道振荡器转移到磁性板分离器2分钟以固定珠子。
- 小心地取下胶板封口剂，确认磁铁和微量滴定板牢固地结合在一起，然后倒置板并倾倒上清液。轻轻地将倒置的板轻轻敲击到吸水纸巾的垫子上，以去除多余的上清液。
- 从珠子中洗涤多余的反应试剂。
- 从磁性板分离器中取出微量滴定板，并向每个孔中加入 150 μL PBS-TBN。
- 将微量滴定板放在磁性板分离器上2分钟以固定珠子。
- 确认磁铁和微量滴定板牢固地结合在一起，然后倒置板并倾倒上清液。轻轻地将倒置的板轻轻敲击到吸水纸巾的垫子上，以去除多余的上清液。
- 重复洗板步骤4.11.1-4.11.3两次，总共用PBS-TBN洗涤三次。在取出最终（第三种）洗涤液之前，确保准备好SAPE试剂（如下）。
- 添加SAPE检测试剂。
- 在PBS-TBN中将储备SAPE储备溶液稀释至6μg/mL工作浓度;腾出足够的体积，以容纳 100 μL/孔，并增加体积以适应移液损失。
- 向每个反应孔中加入 100 μL/孔的 SAPE 工作溶液，并通过移液重新悬浮珠子。
- 密封板，并在室温（18-22°C）下在600rpm的轨道振荡器上在黑暗中孵育1小时。
- 倒出反应中多余的SAPE。
- 将密封板从轨道振荡器转移到磁性板分离器2分钟以固定珠子。
- 小心地取下胶板封口剂，确认磁铁和微量滴定板牢固地结合在一起，然后倒置板并倾倒上清液。轻轻地将倒置的板轻轻敲击到吸水纸巾的垫子上，以去除含有过量SAPE的上清液。
- 从珠子上洗掉多余的SAPE。
- 从磁性板支架上取下微量滴定板。
- 向每个孔中加入 150 μL PBS-TBN 以重悬磁珠。
- 将微量滴定板放在磁性板分离器上2分钟以固定珠子。
- 确认磁铁和微量滴定板牢固地结合在一起，然后倒置板并倾倒上清液。轻轻地将倒置的板轻轻敲击到吸水纸巾的垫子上，以去除多余的上清液。
- 通过重复步骤 4.15.1-4.15.4，使用 PBS-TBN 执行两个额外的洗涤步骤，总共进行三次洗涤。在取出最终（第三种）洗涤液之前，准备好 BV421 混合的二抗检测抗体（下一步）。
- 添加 BV421 聚集的二抗。
- 在洗涤/测定缓冲液中以 1：400 的比例稀释 BV421 结合的抗人 IgG（用于检测人源化对照抗体）和 BV421 结合的抗兔 IgG（用于检测 PDL1-Vaxx 诱导的多克隆抗体）（参见 材料表），其体积足以使用 100 μL/孔，并额外用于适应移液损失。
- 向适当的孔中加入 100 μL 稀释的 BV421 偶联抗人 IgG 或 BV421 偶联的抗兔 IgG。
- 密封板，并在室温（18-22°C）下在600rpm的轨道振荡器上在黑暗中孵育1小时。
- 从磁珠中倒出多余的BV421偶联二抗。
- 将密封板从轨道振荡器转移到磁性板分离器2分钟以固定珠子。
- 小心地取下胶板封口剂，确认磁铁和微量滴定板牢固地结合在一起，然后倒置板并倾倒上清液。将倒置的板轻轻拍打在吸收性纸巾垫上，以去除含有过量BV421偶联二抗的上清液。
- 从珠子中洗涤过量的BV421偶联二抗。
- 向每个孔中加入 150 μL PBS-TBN 以重悬磁珠。
- 将微量滴定板放在磁性板分离器上2分钟以固定珠子。
- 确认磁铁和微量滴定板牢固地结合在一起，然后倒置板并倾倒上清液。轻轻地将倒置的板轻轻敲击到吸水纸巾的垫子上，以去除多余的上清液。
- 通过重复步骤 4.19.1-4.19.3，使用 PBS-TBN 执行三个额外的洗涤步骤，总共进行四次洗涤。
- 除去最后（第四次）洗涤缓冲液后，从磁性板分离器中取出微量滴定板，并用移液器将珠子重悬于100μL PBS-TBN/孔中。
- 分析结果。
- 读取双报告流分析系统上的板，使用以下仪器设置确定每个反应的 MFI：吸液体积 = 50 μL;最小磁珠数 = 100 颗磁珠;超时设置 = 40 秒;门控：7,000-17,000;操作模式 = 双报告器。
- 使用双报告基因系统，确保报告通道 1 测量橙色 PE 荧光（附着在 rhPD-1 偶联微珠上的 rhPD-L1 数量），报告通道 2 测量蓝色 BV421 荧光（与 rhPD-L1 结合的附着阻断抗体数量）。
- 为每个条件运行重复的孔，并在执行进一步的数据计算和绘图之前对每个条件的两个输出MFI值进行平均。
- 将每个样品的MFI值标准化为阴性对照，并计算每个样品的抑制百分比：
抑制% = （100 × [阴性对照 MFI − 样本 MFI]）/阴性对照 MFI
注意：阴性对照 MFI 值（无抑制）是最高值;结合的PD-L1信号MFI为100%，rhPD-L1与rhPD-1结合的抑制定义为0%。
图 1：双报告基因 PD-1/PD-L1 阻断测定示意图。 生物素化的重组人 PD-L1 （rhPD-L1） 与选定的 PDL1-Vaxx 诱导的抗 PDL1 抗体预孵育，然后与 rhPD-1 偶联磁珠结合以形成 PD-1/PD-L1 检查点复合物。然后检测复合物rhPD-L1，并通过添加链霉亲和素偶联藻红蛋白（SAPE，橙色荧光团）进行标记。针对 PDL1-Vaxx 表位的抗体靶向与磁珠预偶联的 rhPD-1 复合的 rhPD-L1，并使用 Brilliant Violet 421 偶联的二抗（BV421，蓝色荧光团）对其进行照明。使用双报告流式细胞术仪器同时分析与 PD-1（PE 信号）复合的生物素化 rhPD-L1 和识别和结合 rhPD-L1（BV421 信号）的抗 PDL1 抗体，该仪器在两个单独的报告基因通道中询问样品中的两种荧光基团。每个样品的输出值是每个荧光团的中值荧光强度。然后通过将实验信号与使用不结合rhPD-L1的阴性对照单克隆抗体（0%抑制）产生的信号进行比较，推断不同PDL1-Vaxx诱导的抗体对PD1 / PD-L1复合物形成的抑制作用。 请点击这里查看此图的较大版本.
Representative Results
该测定能够精确量化四种独特的多克隆抗体对 PD-1/PD-L1 相互作用的抑制作用，这些抗体针对 rhPD-L1 疫苗肽产生，这些抗体正在被探索为潜在的癌症治疗剂。该测定的示意图如 图1所示。使用直接结合rhPD-L1的链霉亲和素-PE检测试剂，在报告通道1中测量与rhPD-1偶联珠结合的生物素化rhPD-L1的量以及四种PLD1-Vaxx诱导的抗体候选物对这种结合的抑制（图2）。
所有四种多克隆抗 PDL1 肽抗体都阻断了 rhPD-L1 与 PD-1 的相互作用，PD-1 在不同程度上被固定在微球上。在最大测试浓度为 1,000 μg/mL 时，不同抗 PDL1 肽抗体的抑制百分比范围为 48% 至 74%。阳性对照单克隆抗体阿替利珠单抗在最大测试浓度14 为 4 μg/mL 时实现了 92% 的 PD-1/PD-L1 相互作用阻断（图 2）。与曲妥珠单抗相比，所有实验性 PDL1-Vaxx 抗体都显示出 rhPD-L1 与 rhPD-1 偶联珠子结合的浓度依赖性抑制，曲妥珠单抗是预计不会与 PD-1/PD-L1 系统相互作用的阴性对照抗体。
图 2：抗 PDL1 肽抗体阻断 rhPD-L1 与偶联到磁珠的 rhPD-1 相互作用，如基于荧光珠的新型免疫测定所示。 将重组人 PD-1 偶联到磁性微球上，然后将微珠与已与不同抗 PDL1 肽抗体预孵育的生物素化 rhPD-L1 一起孵育。使用链霉亲和素-藻红蛋白检测试剂结合生物素，从而评估可用于与 PD-1 结合的 rhPD-L1 的相对量。测试了兔中针对PDL1肽疫苗（抗PDL1[36]、抗PDL1[50]、抗PDL1[95]和抗PDL1[130]）产生的多克隆抗体的抑制活性，在测试的最高浓度下，对重组PD-1/PD-L1相互作用的阻断率为48%-74%。Atezolizumab（一种不同的抗PDL1单克隆抗体）被用作阳性对照。使用无关的商业单克隆抗体曲妥珠单抗（抗HER2）作为阴性对照。该图改编自 Guo et al.14。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：不同 PDL1-Vaxx 诱导的抗体与 rhPD1 包被磁珠复合的 rhPD-L1 的结合比较。 采用亮紫421偶联二抗检测抗体，比较不同兔多克隆抗PDL1肽抗体 通过 rhPD-1包被微珠与rhPD-L1的结合。BV421蓝色荧光信号记录在双报告基因仪的报告通道2中;该信号与实验性抗PDL1肽抗体的相对结合效率相关。曲替珠单抗（抗HER2）是一种单克隆抗体，靶向与PD-1/PD-L1不同的检查点，被用作阴性对照。MFI 表示平均微珠中值荧光强度，该强度是在每个条件下的重复反应孔中测量的。该图改编自 Guo et al.14。 请点击这里查看此图的较大版本.
使用单独的检测系统（BV421 偶联的抗兔 IgG）比较了四种实验性 PDL1-Vaxx 诱导的候选抗体结合 rhPD-L1 的相对能力，该系统在仪器的第二个报告基因通道上进行了评估。这些结果表明，所有四种多克隆抗PDL1肽抗体都以浓度依赖性方式与rhPD-L1结合14 （图3）。抗PDL1（130）抗体在4种PDL1-Vaxx诱导的候选抗体中显示出最高的rhPDL1结合信号。
Discussion
检查点相关癌症免疫疗法的目的是破坏检查点蛋白与其重要配体在肿瘤存活和进展中的相互作用2.该研究小组正在积极开发新型 PD-1 和 PD-L1 疫苗，这些疫苗可引发靶向和中断 PD-1/PD-L1 检查点 3,8,13,14 的抗体反应。此前，进行了两种酶联免疫吸附测定 （ELISA） 来评估抗 PDL1 肽抗体对抑制重组 PD1/PD-L1 相互作用的影响14。（1）在第一种变体中，将rhPD-L1包被在微量滴定板上，然后用稀释的抗PDL1候选疫苗诱导抗体孵育该板。然后通过添加生物素化的 rhPD-1 并使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物和比色底物定量与固定化的 rhPD-L1 的结合来评估抗体对重组 PD-1/PD-L1 相互作用的抑制。我们将其定义为直接阻断试验。（2）在第二种变体中，PD-1被涂覆在微量滴定板上。生物素化的 rhPD-L1 与每种抗 PLD1 候选诱导的多克隆抗体在单独的反应管中预孵育。然后将 rhPDL1/抗 PDL1 混合物加入到含有固定化 rhPD-1 的板孔中并使其反应。在随后的链霉亲和素-HRP 和比色底物孵育中检测到在潜在阻断 PDL1-Vaxx 诱导的抗体存在下与固定化 rhPD-1 反应的任何 rhPDL1。我们将其定义为反向阻断试验。
抗PDL1肽抗体对重组PD-1/PD-L1相互作用的反向阻断显示出对信号的抑制（即PD-1/PD-L1阻断）以抗体浓度依赖性的方式14，而直接阻断方法没有提供一致的结果（未显示）。开发了基于微珠的双报告基因阻断试验，以验证 ELISA 结果并研究流体相中 PD-1/PD-L1 相互作用的阻断，从而消除了与固定重组蛋白在井底相关的潜在空间位阻/结合表位可用性问题。微球分析与使用反向阻断试验的ELISA阻断结果直接相关（图2）。此外，与比色 ELISA18 相比，基于荧光的免疫测定可以提供更高的检测灵敏度和更宽的动态范围，此外，基于微珠的多重检测允许在一次反应中同时进行两种独立的免疫测定。用于微球与rhPD-1共价偶联的磺基-NHS和EDC可能导致直接封闭和反向封闭试验之间的性能差异，以及ELISA和基于Luminex微球的重组PD-1/PD-L1相互作用试验之间观察到的灵敏度差异。有必要进行进一步的化学和分子水平研究，以研究造成这些差异的可能机制。
ELISA14 和基于微珠的检测均表明，PDL1-Vaxx 诱导的抗 PDL1 抗体可以抑制 PD1/PD-L1 检查点复合物的形成。基于肽的 PDL1-Vaxx 成功诱导可阻断 PD-1/PD-L1 相互作用的抗 PDL1 抗体。这种方法可以作为治疗癌症的一种新治疗策略，正如临床前动物研究所支持的那样 3,13,14。计划中的临床试验将确定 PDL1-Vaxx 对癌症患者检查点免疫治疗和疾病控制的疗效。
Disclosures
Pravin T.P. Kaumaya 是 Imugene， Ltd. 的顾问。
Acknowledgments
作者感谢 Luminex Corporation（德克萨斯州奥斯汀）的 MBA Sherry Dunbar 博士的研究支持，以及 Biomedical Publishing Solutions（佛罗里达州巴拿马城;mattsilver@yahoo.com 年）的 Matthew Silverman 博士提供的科学和写作帮助。这项工作得到了美国国立卫生研究院（R21 CA13508 和 R01 CA84356）和澳大利亚悉尼 Imugene Ltd（OSU 900600、GR110567 和 GR124326）的 Pravin TP Kaumaya 的奖项支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffers | |||
| Activation Buffer: 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2 | Millipore/Sigma | S3139 | |
| Assay/Wash Buffer: PBS-TBN (1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3) | Millipore/Sigma | P3563 (PBS+Tween20), A7888 (Bovine serum albumin), S8032 (sodium azide) | |
| Coupling Buffer: 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 5.0 | MilliporeSigma | M2933 | |
| Coupling Reagents | |||
| 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 77149 | |
| xMAP Antibody Coupling Kit (if desired), includes: | Luminex Corp. (Austin, TX) | 40-50016 | |
| EDC, 10 mg | |||
| sNHS solution, 250 µL | |||
| Activation/Coupling Buffer: 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 6.0 | |||
| Wash Buffer: 1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3 (PBS-TBN) | |||
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 24510 | |
| Instrumentation and Ancillary Lab Supplies | |||
| xMAP INTELLIFLEX (dual-reporter instrument) | Luminex Corp. (Austin, TX) | INTELLIFLEX-DRSE-RUO | |
| Low protein-binding round bottom 96-well plate | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 07-200-761 | |
| Luminex Magnetic Plate Separator (or comparable) | Luminex Corp. (Austin, TX) | CN-0269-01 | |
| Luminex Magnetic Tube Separator (or comparable) | Luminex Corp. (Austin, TX) | CN-0288-01 | |
| MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) | Luminex Corp. (Austin, TX) | MC-1**** (varies by bead label) | |
| Protein LoBind microcentrifuge tubes | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 022431081 | |
| Peptides, Antibodies, & Detection Reagents | |||
| Atezolizumab (humanized anti-PDL1 IgG1 monoclonal antibody), positive control | Genentech/Roche (San Francisco, CA) | n/a (prescription medications) | |
| Biotinylated recombinant human PDL1 | Sino Biological (Wayne, PA) | 10084-H49H-B | |
| Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-human IgG | Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA) | 709-675-149 | |
| Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA) | 711-675-152 | |
| Recombinant human PD-1 (poly-histidine tagged) | Acro Biosystems (Newark, DE) | PD1-H5256 | |
| Streptavidin-conjugated R-phycoerythrin (SAPE) | Agilent (Santa Clara, CA) | PJRS34-1 | |
| Trastuzumab (Herceptin, humanized anti-HER2 monoclonal antibody), negative control | Genentech/Roche (San Francisco, CA) | n/a (prescription medications) |
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