Valutazione rapida della citotossicità in vitro del recettore dell'antigene chimerico che esprime Jurkat mediante imaging fluorescente
Summary
Un protocollo per valutare l’uccisione quantitativa delle cellule tumorali da parte delle cellule Jurkat che esprimono il recettore dell’antigene chimerico (CAR) mirato all’antigene tumorale singolo. Questo protocollo può essere utilizzato come piattaforma di screening per una rapida ottimizzazione dei costrutti di cerniera CAR prima della conferma nelle cellule T derivate dal sangue periferico.
Abstract
Le cellule T del recettore chimerico dell’antigene (CAR) sono all’avanguardia in oncologia. Una CAR è costituita da un dominio di targeting (di solito un frammento variabile a catena singola, scFv), con un linker intra-catena di accompagnamento, seguito da un dominio cerniera, transmembrana e costimolatorio. La modifica del linker intra-catena e del dominio della cerniera può avere un effetto significativo sull’uccisione mediata da CAR. Considerando le molte opzioni diverse per ogni parte di un costrutto CAR, esiste un gran numero di permutazioni. La produzione di celle CAR-T è un processo lungo e costoso e la realizzazione e il collaudo di molti costrutti richiede un notevole investimento in termini di tempo e materiali. Questo protocollo descrive una piattaforma per valutare rapidamente i costrutti CAR ottimizzati per cerniera nelle cellule Jurkat (CAR-J). Le cellule Jurkat sono una linea di cellule T immortalizzate con un elevato assorbimento di lentivirus, che consente un’efficiente trasduzione delle CAR. Qui, presentiamo una piattaforma per valutare rapidamente CAR-J utilizzando un imager fluorescente, seguito dalla conferma della citolisi nelle cellule T derivate da PBMC.
Introduction
La terapia cellulare CAR-T si è dimostrata molto promettente nelle neoplasie ematologiche, come evidenziato dai 6 prodotti CAR-T approvati dalla FDA dal 2017, come riportato dal National Cancer Institute1. Ci sono numerose cellule CAR-T negli studi clinici per colpire i tumori solidi. La progettazione di nuovi bersagli CAR e l’ottimizzazione del costrutto CAR sono fondamentali per l’efficacia di una cellula CAR-T. La scelta del costrutto CAR ideale per ogni applicazione è essenziale per un targeting accurato degli antigeni associati al tumore (TAA), evitando al contempo bassi livelli di espressione di TAA nei tessuti normali2.
Un costrutto CAR è costituito principalmente da cinque compartimenti: (1) dominio extracellulare a frammento variabile a catena singola (scFv) che ha come bersaglio l’antigene tumorale; (2) dominio cerniera; (3) dominio transmembrana; (4) dominio costimolatorio delle cellule T citoplasmatiche intracellulari; e (5) dominio di segnalazione. La modifica di ciascuno di questi domini influisce sulla precisione della cellula CAR-T che interagisce con la sua cellula bersaglio3. Pertanto, la valutazione della citotossicità e della cross-reattività di questi costrutti CAR in vitro è fondamentale per scegliere il costrutto giusto per progredire verso gli esperimenti in vivo. Gli attuali metodi di valutazione della citolisi da parte delle cellule T includono il test di rilascio di 51Cr, il test di rilascio della lattato deidrogenasi, il test di imaging bioluminescente, l’analisi cellulare basata sull’impedenza in tempo reale e il test di citometria a flusso cellulare 4,5. La piattaforma basata sull’imaging fluorescente qui descritta identifica il numero di cellule vive rispetto a quelle morte, che è una quantificazione diretta della citolisi delle cellule T in contrapposizione a un metodo indiretto di valutazione della citolisi da parte delle cellule T.
Ecco una tecnica semplice, economica, rapida e ad alto rendimento con un intervento minimo per valutare la citotossicità delle cellule Jurkat che esprimono il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) CAR contro le cellule di carcinoma mammario triplo negativo (TNBC) MDA-MB-231 e le cellule MDA-MB-231 knock out EGFR CRISPR. Le cellule Jurkat sono cellule dei linfociti T umani immortalizzate6 che sono state ampiamente utilizzate per studiare l’attivazione delle cellule T e i meccanismi di segnalazione7. Inoltre, le cellule Jurkat sono state utilizzate per test CAR in vitro in diversi studi 8,9,10,11. Le cellule Jurkat sono facilmente trasdotte dai lentivirus e hanno una proliferazione sostenuta, e questo sistema è stato sfruttato per ottimizzare il dominio cerniera di vari costrutti EGFR CAR.
Questo test può essere utilizzato per lo screening di più costrutti CAR mirati a vari antigeni tumorali e utilizzato contro più linee cellulari tumorali aderenti e in vari rapporti effettore/tumore (E:T). Inoltre, è possibile valutare più punti temporali e modificare il numero di repliche per identificare la migliore uccisione tra i vari costrutti CAR. I migliori costrutti devono essere confermati utilizzando cellule T CD3 derivate da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). L’obiettivo generale alla base dello sviluppo di questo metodo è quello di ottimizzare rapidamente la geometria della cerniera CAR in modo ad alto rendimento, superando barriere come la bassa efficienza di trasduzione, seguita dalla conferma nelle cellule T derivate da PBMC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui abbiamo proposto un metodo rapido per valutare in modo efficiente l’attività citolitica target-specifica indotta dall’espressione di CAR nelle cellule Jurkat. Tutti i costrutti CAR hanno lo stesso scFv ma diversi domini cerniera e transmembrana che hanno dimostrato di influenzare la potenza delle cellule CAR-T13. Un’ulteriore valutazione dell’uccisione non specifica da parte di queste CAR-J è stata effettuata coltivandole con cellule knock out dell’antigene (KO). Ciò dimostra che l’uccision…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MDA-MB-231 è stato un gentile regalo del Dr. Shane Stecklein. Gli autori riconoscono il finanziamento da parte dell’Università del Kansas Cancer Center per condurre questa ricerca.
Materials
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
Referências
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