형광 이미징을 사용한 Jurkat 발현 키메라 항원 수용체의 신속한 체외 세포 독성 평가
Summary
단일 종양 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 Jurkat 세포에 의한 정량적 종양 세포 사멸을 평가하기 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 말초 혈액 유래 T 세포에서 확인하기 전에 CAR hinge 구조를 신속하게 최적화하기 위한 스크리닝 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.
Abstract
키메라 항원 수용체(CAR) T 세포는 종양학의 최전선에 있습니다. CAR은 표적 도메인(일반적으로 단일 사슬 변수 단편, scFv)으로 구성되며, 동반되는 사슬 내 링커와 힌지, 막관통 및 늑골 도메인이 뒤따릅니다. 사슬 내 링커(intra-chain linker)와 힌지 도메인(hinge domain)의 변형은 CAR 매개 사멸에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. CAR 구성의 각 부분에 대한 다양한 옵션을 고려할 때 많은 수의 순열이 있습니다. CAR-T 세포를 만드는 것은 시간과 비용이 많이 드는 공정이며, 많은 구조를 만들고 테스트하는 것은 많은 시간과 재료 투자입니다. 이 프로토콜은 Jurkat 세포(CAR-J)에서 힌지 최적화 CAR 구조를 신속하게 평가하기 위한 플랫폼을 설명합니다. Jurkat 세포는 렌티바이러스 흡수율이 높은 불멸화된 T 세포주로, 효율적인 CAR transduction이 가능합니다. 여기서는 형광 이미저를 사용하여 CAR-J를 신속하게 평가한 후 PBMC 유래 T 세포의 세포 용해를 확인할 수 있는 플랫폼을 제시합니다.
Introduction
미국 국립암연구소(National Cancer Institute)가 발표한 바에 따르면, CAR-T 세포 치료제는 2017년 이후 FDA가 승인한 6개의 CAR-T 제품에서 분명하게 드러나는 혈액 악성 종양에 대한 큰 가능성을 보여주었습니다1. 고형 종양을 표적으로 하는 수많은 CAR-T 세포가 임상시험에 참여하고 있습니다. 새로운 CAR 표적을 엔지니어링하고 CAR 구조를 최적화하는 것은 CAR-T 세포의 효능에 매우 중요합니다. 종양 관련 항원(TAA)을 정확하게 표적화하는 동시에 정상 조직에서 낮은 수준의 TAA 발현을 피하기 위해서는 각 응용 분야에 이상적인 CAR 구조를 선택하는 것이 필수적이다2.
CAR 구조체는 주로 5개의 구획으로 이루어진다: (1) 종양 항원을 표적으로 하는 세포외 단일사슬 가변 단편(scFv) 도메인; (2) 힌지 도메인; (3) 막관통 도메인; (4) 세포내 세포질 T 세포 늑골 도메인; 및 (5) 신호 영역. 이러한 각 도메인의 변형은 표적 셀3과 결합하는 CAR-T 셀의 정밀도에 영향을 미칩니다. 따라서 in vitro에서 이러한 CAR 구조체의 세포 독성 및 교차 반응성을 평가하는 것은 in vivo 실험을 진행하기 위한 올바른 구조체를 선택하는 데 중요합니다. 현재 T 세포에 의한 세포 분해를 평가하는 방법에는 51Cr 방출 분석, 젖산 탈수소효소 방출 분석, 생물 발광 이미징 분석, 실시간 임피던스 기반 세포 분석 및 세포 기반 유세포 분석분석 4,5가 포함됩니다. 여기에 설명된 형광 이미징 기반 플랫폼은 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 식별하며, 이는 T 세포에 의한 세포 용해를 평가하는 간접적인 방법과 달리 T 세포 세포 용해의 직접적인 정량화입니다.
다음은 MDA-MB-231 삼중음성 유방암(TNBC) 세포 및 EGFR CRISPR knock out MDA-MB-231 세포에 대한 표피 성장 인자 수용체(EGFR) CAR을 발현하는 Jurkat 세포의 세포 독성을 평가하기 위한 최소한의 개입으로 쉽고 비용 효율적이며 빠르고 처리량이 높은 기술입니다. 주르캣 세포(Jurkat cell)는 불멸의 인간 T 림프구 세포(human T lymphocyte cell)6로, T 세포 활성화 및 신호전달 기전을 연구하는 데 널리 사용되어 왔다7. 또한, Jurkat 세포는 여러 연구에서 시험관 내 CAR 테스트에 사용되었습니다 8,9,10,11. Jurkat 세포는 렌티바이러스에 의해 쉽게 transduction되고 지속적인 증식을 가지고 있으며, 이 시스템은 다양한 EGFR CAR 구조의 힌지 도메인을 최적화하는 데 활용되었습니다.
이 분석법은 다양한 종양 항원을 표적으로 하는 여러 CAR 구조체를 스크리닝하는 데 사용할 수 있으며 여러 부착 종양 세포주 및 다양한 이펙터 대 종양(E:T) 비율에 사용할 수 있습니다. 또한 여러 시점을 평가할 수 있으며 반복실험 횟수를 수정하여 다양한 CAR 구성 중에서 최상의 사멸을 식별할 수 있습니다. 최상의 구성물은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 유래 CD3 T 세포를 사용하여 확인해야 합니다. 이 방법 개발의 전반적인 목표는 낮은 형질도입 효율과 같은 장벽을 극복하고 PBMC 유래 T 세포를 확인하는 고처리량 방식으로 CAR 힌지 형상을 신속하게 최적화하는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 Jurkat 세포에서 CAR 발현에 의해 유도된 표적 특이적 세포 용해 활성을 효율적으로 평가할 수 있는 신속한 방법을 제안했습니다. 모든 CAR 구조체는 동일한 scFv를 갖지만 CAR-T 세포 효능에 영향을 미치는 것으로 밝혀진 힌지 및 막관통 도메인이 다릅니다13. 이들 CAR-J에 의한 비특이적 사멸에 대한 추가 평가는 항원 녹아웃(KO) 세포로 배양하여 수행되었습니다. 이는 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MDA-MB-231은 셰인 스테클라인 박사의 친절한 선물이었습니다. 저자들은 이 연구를 수행하기 위해 캔자스 대학 암 센터(University of Kansas Cancer Center)의 자금 지원을 인정합니다.
Materials
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
Referências
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
- Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. . Methods in Cell Biology. 167, 81-98 (2022).
- Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
- Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
- Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
- Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
- Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
- Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
- Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
- Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D., Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
- Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
- Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
- Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
- Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
- . Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis Available from: https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023)
- Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).
