מודל מיקרופלואידי של אנטרוקוליטיס נמקית המשלב אנטרואידים ממעיים של ילודים אנושיים ומיקרוביום דיסביוטי
Summary
פרוטוקול זה מתאר מודל במבחנה של אנטרוקוליטיס נמקית (NEC), אשר יכול לשמש למחקרים מכניסטיים על פתוגנזה של מחלות. הוא מכיל שבב מיקרופלואידי שנזרע עם אנטרואידים במעי שמקורם במעי היילוד האנושי, תאי אנדותל ומיקרוביום המעי של יילוד עם NEC חמור.
Abstract
Necrotizing enterocolitis (NEC) היא מחלת מעיים חמורה וקטלנית שקשה לחקור בשל הפתוגנזה המורכבת שלה, שנותרה מובנת לחלוטין. הפתופיזיולוגיה של NEC כוללת הפרעה בצמתים ההדוקים של המעי, חדירות מוגברת של מחסום המעי, מוות של תאי אפיתל, דיסביוזיס מיקרוביאלי ודלקת לא מווסתת. הכלים המסורתיים לחקר NEC כוללים מודלים של בעלי חיים, קווי תאים ואורגנואידים של מעיים אנושיים או עכברים. בעוד שמחקרים המשתמשים במערכות מודל אלה שיפרו את הבנת התחום של פתופיזיולוגיה של מחלות, יכולתם לשחזר את המורכבות של NEC אנושי מוגבלת. כעת פותח מודל משופר במבחנה של NEC בטכנולוגיה מיקרופלואידית, בשם NEC-on-a-chip. מודל NEC-on-a-chip מורכב ממכשיר מיקרופלואידי שנזרע עם אנטרואידים במעי שמקורם ביילוד מוקדם, בתרבית משותפת עם תאי אנדותל אנושיים ובמיקרוביום מתינוק עם NEC חמור. מודל זה הוא כלי רב ערך למחקרים מכניסטיים על הפתופיזיולוגיה של NEC ומשאב חדש לבדיקות גילוי תרופות למחלות מעיים בילוד. בכתב יד זה יסופק תיאור מפורט של מודל NEC-on-a-chip.
Introduction
Necrotizing enterocolitis (NEC) משפיע על פגים, עם שכיחות של עד 10% אצל אלה שנולדו במשקל < 1500 גרם1. הפתופיזיולוגיה של NEC מורכבת וכוללת נזק לאפיתל המעי, הפרעה בצמתים הדוקים של המעי, חדירות מוגברת של מחסום המעי, חוסר ויסות חיסוני ומוות תאי אפיתל 2,3. הבנתנו את המנגנונים המעורבים בפתוגנזה של NEC נותרה חלקית, ולמרות עשרות שנים של מחקר, עדיין אין טיפולים ממוקדים יעילים.
חסם משמעותי לקידום מחקר ה-NEC הוא הזמינות המוגבלת והגודל הקטן של רקמת המעי הראשונית שבודדה מתינוקות אנושיים. רקמת מעי שנכרתה מתינוקות עם NEC היא לעתים קרובות נמקית ופגומה קשות, מה שמסבך מחקרים על מנגנונים שמקדימים את הופעת המחלה. לדוגמה, המעי הדק של תינוקות עם NEC מוצף בתאי מערכת החיסון, ומספר מופחת של תאי גזע במעי, ירידה בשגשוג תאי אפיתל ואפופטוזיס מוגבר של תאי אפיתל נצפים גם הם 4,5,6,7. זה מוביל לקשיים בגידול תאי אפיתל מעיים מדגימות אלה ובבידוד RNA וחלבונים, שיכולים להתפרק בסביבה דלקתית עוינת זו. בנוסף, מכיוון שתהליך המחלה כבר מתקדם בתינוקות עם NEC ניתוחי, מחקרים מכניסטיים על גורמים הגורמים למחלה אינם ישימים. מגבלות אלה הובילו להסתמכות על מודלים של בעלי חיים למחקרים מכניסטיים של NEC.
מודלים של בעלי חיים של NEC הוקמו עבור עכברים, חולדות, חזרזירים, ארנבות ובבונים 5,8,9,11. חוזק של מודלים של בעלי חיים הוא שמחלת מעיים דמוית NEC נגרמת על ידי גורמים הקשורים להופעת NEC בבני אדם, כולל מיקרוביום דיסביוטיקה, אפיזודות חוזרות ונשנות של היפוקסיה, והיעדר חלב אם מזין 5,8,10,11. בנוסף, התגובה הדלקתית והשינויים הפתולוגיים שנצפו במהלך ניסוי NEC מקביל למחלה אנושית 5,9,12. בעוד מודלים אלה מחקים רבים מהמאפיינים של NEC אנושי, ישנם הבדלים מובנים בין הפתופיזיולוגיה של NEC בבעלי חיים ובבני אדם. לדוגמה, מודל מורין של NEC מושרה בעכברים שנולדו לטווח מלא, ולמרות שהתפתחות המעי שלהם אינה שלמה, הפתופיזיולוגיה של NEC שונה מטבעה בהקשר קליני זה. ביטוי גנים במעי מורין בלידה דומה לעובר אנושי בר קיימא ואינו מתקרב לזה של פג בהריון של 22-24 שבועות עד היום ה-14 (P14)13. זה מבלבל את מודל NEC מורין מכיוון שבדרך כלל לא ניתן לגרום לפגיעה במעיים בעכברים לאחר P10. בנוסף, זנים גזעיים של עכברים חסרים את המגוון החיסוני14 והמיקרוביולוגי של יילודים אנושיים15, המשמש גורם מבלבל נוסף. לפיכך, שילוב מוגבר של דגימות אנושיות ראשוניות במחקר NEC משפר את הרלוונטיות הקלינית של מחקרים בתחום זה.
מחקרים על המנגנונים של NEC במבחנה השתמשו באופן מסורתי בשורות תאים מונוטיפיים שמקורם בתאי סרטן מעיים בוגרים, כגון אדנוקרצינומה של המעי הגס (Caco2) ותאי אדנוקרצינומה של המעי הגס האנושי (HT-29)16. מודלים אלה נוחים אך מוגבלים ברלוונטיות הפיזיולוגית שלהם בשל גדילתם מתאי סרטן בוגרים, ארכיטקטורה לא מקוטבת ושינויים פנוטיפיים הקשורים למעברים חוזרים ונשנים בתרבית. אנטרואידים במעיים משפרים מודלים אלה מכיוון שניתן לגדל אותם מהקריפטות של רקמת המעי, להתמיין לכל תת-סוגי אפיתל המעי, וליצור מבנה תלת ממדי (3D) דמוי וילוס17,18,19,20. לאחרונה, אנטרואידים במעי שולבו עם טכנולוגיה מיקרופלואידית כדי לפתח מודל מעי דק על שבב ולספק מערכת מודל במבחנה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית21.
המכשירים המיקרופלואידים הראשוניים של איבר על שבב הוצגו בתחילת שנות ה-200022,23,24. המודל הראשון של איבר על שבב היה ריאות על שבב25. אחריו הופיעו מודלים רבים של איברים בודדים כגון מעי 21, כבד 26, כליות 27, מח עצם 28, מחסום דם-מוח 29 ולב30. מודלים אלה של איבר על שבב שימשו לחקר מחלות חריפות, כרוניות ונדירות, כולל תסמונת קרינה חריפה,31 מחלת ריאות חסימתית כרונית,32 ומחלות נוירודגנרטיביות 33. האופי המקוטב של התאים על שבבים אלה ונוכחותם של שני תאי תאים המופרדים על ידי קרום נקבובי מאפשר מידול של תהליכים פיזיולוגיים מורכבים כגון זילוח, שיפועי ריכוז כימיים וכימוטקסיס34,35 של תאי מערכת החיסון. מערכות מיקרופלואידיות אלה מספקות אפוא כלי חדש לחקר הפתופיזיולוגיה והמנגנונים של מחלות אנושיות.
מודל המעי הדק על שבב תואר על ידי Kasendra et al. בשנת 2018, שהשתמשו בדגימות ביופסיה של מעי דק ילדים (גילאי 10-14) שהתמיינו לאנטרואידים וגודלו בתרבית במכשיר מיקרופלואידי21. תאי אנדותל של כלי הדם, זרימת מדיה רציפה ומתיחה/הרפיה שולבו גם הם במודל זה. הם צפו בהתמיינות תת-סוג אפיתל במעי, היווצרות צירים תלת-ממדיים דמויי וילוס (villus), ייצור ריר ודפוסי ביטוי גנים במעי הדק21. מודל מיקרופלואידי זה יושם על מחלות יילודים עם פיתוח מערכת NEC-on-a-chip, המשלבת אנטרואידים של מעיים בילוד, תאי אנדותל ואת המיקרוביום מיילוד עם NEC36. NEC-on-a-chip משחזר רבים מהמאפיינים הקריטיים של NEC אנושי, כולל ביטוי גנים דלקתיים, אובדן תאי אפיתל מיוחדים ותפקוד מופחת של מחסום המעי36. לפיכך, למודל זה יש יישומים רבים בחקר NEC, כולל מחקרים מכניסטיים וגילוי תרופות. בכתב יד זה מסופק פרוטוקול מפורט לביצוע מודל NEC-on-a-chip.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת NEC-on-a-chip זו היא כלי חדש רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי למדל את הפתופיזיולוגיה של NEC. פלטפורמה זו מספקת מיקרו-סביבה מורכבת הדומה יותר לסביבת המעי in vivo מאשר דגמים קודמים על ידי שילוב מערכת תרבות משותפת עם זרימה ומתיחות לומינליות רציפות. התנאים האלה מקדמים את התפתחותה של ארכיטקטורה תל?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
כתב יד זה נתמך על ידי R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) ו-R01HD105301 (MG) מהמכונים הלאומיים לבריאות, מענק יוזמת צ’אן צוקרברג 2022-316749 (MG), פרס קריירה מוקדמת של קרן המחקר Thrasher Research Fund (LCF), מענק חוקר קריירה מוקדמת של התפתחות ילדים של UNC (LCF) באמצעות תמיכתם הנדיבה של תורמים לאוניברסיטת צפון קרוליינה בצ’אפל היל, והמחלקה לרפואת ילדים באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ’אפל היל.
Materials
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| A 83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Gibco | 12634010 | |
| B-27 Supplement, serum free (50x) | Gibco | 17504044 | |
| Basic Bio-kit | Emulate | N/A | |
| BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | Agilent | 7131000 | |
| BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro | BrandTech | 759085D | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| CFX Opus Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chip Cradle | Emulate | N/A | |
| Chip-S1 Stretchable Chip | Emulate | N/A | |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates, 48 well | Corning | 3548 | |
| Collagen from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
| Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit | Cell Biologics | H-1168 | |
| Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess II automated cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Invitrogen | D3571 | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7132 | Permeability dye |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane | Fisher Scientific | FB12566504 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | Corning | 46-034-CI | |
| ER-1 surface activation reagent | Emulate | ER-1 | Chip Activation Reagent 1 |
| ER-2 surface activation reagent | Emulate | ER-2 | Chip Activation Reagent 2 |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics | 6950 | |
| Genie Temp-Shaker 300 | Scientific Industries, Inc. | SI-G300 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | |
| HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) | Corning | 25-060-CI | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Invitrogen | H3570 | |
| Human Collagen Type I | Sigma-Aldrich | CC050 | |
| Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells | Cell Biologics | H-6054 | |
| Inverted Microscope | Fisher Scientific | 03-000-013 | |
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Broth (LB) agar, Miller | Supelco | L3027 | |
| L-WRN Cells | American Type Culture Collection | CRL-3276 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356231 | Cell Culture Matrix |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | 1009005 | |
| NAILSTAR UV LAMP | NailStar | NS-01-US | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-274200 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | 72340 | |
| Orb-HM1 Hub Module | Emulate | N/A | |
| Paraformaldehyde | ThermoFisher | 047392.9L | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | |
| Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 | Rainin | 17014966 | |
| Pod Portable Module | Emulate | N/A | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated) | Avantor Seradigm | 1500-500 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated | Corning | 431111 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
| Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SE1M179M6 | |
| Sterile Cell Strainers, 70um | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Sterile Syringes, 10mL | Fisher Scientific | 14-955-453 | |
| Straight, fine, sharp point scissors | Miltex Instruments | MH5-300 | |
| Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge | Thermo Scientific | 75016052 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Detergent |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | RNA extraction reagent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 | Corning | 25-900-CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12604013 | Enzymatic Dissociation Reagent |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L | Thermo Scientific | 13-998-252 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| Zoë-CM1 Culture Module | Emulate | N/A |
Referências
- Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis. BMC Pediatrics. 20 (1), 344 (2020).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
- Frazer, L. C., Good, M. Intestinal epithelium in early life. Mucosal Immunology. 15 (6), 1181-1187 (2022).
- Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2′-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. The British Journal of Nutrition. 116 (7), 1175-1187 (2016).
- Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. Methods in Molecular Biology. 2321, 101-110 (2021).
- Afrazi, A., et al. Toll-like receptor 4-mediated endoplasmic reticulum stress in intestinal crypts induces necrotizing enterocolitis. The Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9584-9599 (2014).
- Neal, M. D., et al. Toll-like receptor 4 is expressed on intestinal stem cells and regulates their proliferation and apoptosis via the p53 up-regulated modulator of apoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37296-37308 (2012).
- Sodhi, C., Richardson, W., Gribar, S., Hackam, D. J. The development of animal models for the study of necrotizing enterocolitis. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 94-98 (2008).
- Ares, G. J., McElroy, S. J., Hunter, C. J. The science and necessity of using animal models in the study of necrotizing enterocolitis. Seminars in pediatric surgery. 27 (1), 29-33 (2018).
- Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
- Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocol. 2 (4), 100951 (2021).
- Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
- Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. 88 (1), 66-76 (2020).
- Noll, K. E., Ferris, M. T., Heise, M. T. The Collaborative Cross: A Systems Genetics Resource for Studying Host-Pathogen Interactions. Cell Host Microbe. 25 (4), 484-498 (2019).
- Ericsson, A. C., Franklin, C. L. The gut microbiome of laboratory mice: considerations and best practices for translational research. Mammalian Genome. 32 (4), 239-250 (2021).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing Enterocolitis: Overview on In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 2871 (2018).
- Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
- Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
- Sung, J. H., Shuler, M. L. A micro cell culture analog (microCCA) with 3-D hydrogel culture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity of anti-cancer drugs. Lab Chip. 9 (10), 1385-1394 (2009).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Jang, K. J., et al. Reproducing human and cross-species drug toxicities using a Liver-Chip. Science translational medicine. 11 (517), eaax5516 (2019).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature biomedical engineering. 1, 0069 (2017).
- Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature biomedical engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
- Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
- Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
- Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Modeling radiation injury-induced cell death and countermeasure drug responses in a human Gut-on-a-Chip. Cell Death & Disease. 9 (2), 223 (2018).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. On-chip 3D neuromuscular model for drug screening and precision medicine in neuromuscular disease. Nature Protocols. 15 (2), 421-449 (2020).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
- Xiang, Y., et al. Gut-on-chip: Recreating human intestine in vitro. Journal of tissue engineering. 11, 2041731420965318 (2020).
- Lanik, W. E., et al. Microfluidic device facilitates in vitro modeling of human neonatal necrotizing enterocolitis-on-a-chip. JCI Insight. 8 (8), e146496 (2023).
- Emulate. . Duodenum Intestine-Chip Protocol. , (2022).
- Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus HN001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: evidence in mice for a role of TLR9 . American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
- JoVE Science Education Database. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. JoVE. , (2023).
- VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
