Modelo Microfluídico de Enterocolite Necrosante Incorporando Enteróides Intestinais Neonatais Humanos e um Microbioma Disbiótico

Resumo

Este protocolo descreve um modelo in vitro de enterocolite necrosante (ECN), que pode ser usado para estudos mecanísticos da patogênese da doença. Apresenta um chip microfluídico semeado com enteróides intestinais derivados do intestino neonatal humano, células endoteliais e o microbioma intestinal de um neonato com ECN grave.

Resumo

A enterocolite necrosante (ECN) é uma doença intestinal grave e potencialmente fatal que tem sido difícil de estudar devido à sua complexa patogênese, que permanece incompletamente compreendida. A fisiopatologia da ECN inclui ruptura das tight junctions intestinais, aumento da permeabilidade da barreira intestinal, morte de células epiteliais, disbiose microbiana e inflamação desregulada. Ferramentas tradicionais para estudar NEC incluem modelos animais, linhagens celulares, e organoides intestinais humanos ou de camundongos. Embora os estudos usando esses sistemas modelo tenham melhorado a compreensão da fisiopatologia da doença, sua capacidade de recapitular a complexidade da ECN humana é limitada. Um modelo melhorado in vitro de NEC usando tecnologia microfluídica, chamado NEC-on-a-chip, foi agora desenvolvido. O modelo NEC-on-a-chip consiste em um dispositivo microfluídico semeado com enteróides intestinais derivados de um neonato prematuro, co-cultivado com células endoteliais humanas e o microbioma de um lactente com ECN grave. Este modelo é uma ferramenta valiosa para estudos mecanísticos sobre a fisiopatologia da ECN e um novo recurso para testes de descoberta de drogas para doenças intestinais neonatais. Neste manuscrito, uma descrição detalhada do modelo NEC-on-a-chip será fornecida.

Introdução

A enterocolite necrosante (ECN) acomete prematuros, com incidência de até 10% naqueles nascidos com peso < 1500 g¹. A fisiopatologia da ECN é complexa e inclui danos ao epitélio intestinal, ruptura das tight junctions intestinais, aumento da permeabilidade da barreira intestinal, desregulação imunológica e morte de células epiteliais ^2,3. Nossa compreensão dos mecanismos envolvidos na patogênese da ECN permanece incompleta e, apesar de décadas de pesquisa, ainda não existem terapias-alvo eficazes.

Uma barreira significativa para o avanço da pesquisa da NEC é ....

Protocolo

Os enteroides foram derivados de amostras do intestino delgado de prematuros (nascidos entre 22 e 36 semanas de gestação) obtidas no momento da cirurgia para ECN ou outras condições intestinais com etiologias não inflamatórias. Toda a coleta e processamento dos espécimes foram realizados após consentimento informado e aprovação dos Comitês de Revisão Institucional da Washington University em St. Louis (números do protocolo IRB 201706182 e 201804040) e da University of North Carolina at Chapel Hill (protocolo IRB número 21-3134).

1. Isolamento e plaqueamento de criptas do intestino delgado neonatal humano para estabelecimento de enteró....

Resultados

Os enteróides foram semeados no dispositivo microfluídico (Figura 1) e cultivados conforme descrito acima. O crescimento dos enteróides em hidrogel de matriz de cultura celular antes da semeadura e, em seguida, a expansão subsequente da monocamada de células epiteliais intestinais após a semeadura do dispositivo foi monitorado por microscopia de campo claro (Figura 2). Uma monocamada de células epiteliais intestinais confluentes formou-se e posteriormente desenv.......

Discussão

Este sistema NEC-on-a-chip é uma nova e poderosa ferramenta que pode ser usada para modelar a fisiopatologia da ECN. Esta plataforma fornece um microambiente complexo que mais se assemelha ao meio intestinal in vivo do que os modelos anteriores, incorporando um sistema de co-cultura com fluxo luminal contínuo e estiramento. Essas condições promovem o desenvolvimento de uma arquitetura 3D vilosímile revestida por um epitélio altamente polarizado, constituído por subtipos epiteliais maduros e tight junctions (

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
[Leu15]-Gastrin I humano	Sigma-Aldrich	G9145
A 83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Gibco	12634010
B-27 Supplement, sem soro (50x)	Gibco	17504044
Basic Bio-kit	Emulate	N/A
Leitor de Microplacas Multimodo BioTek Synergy 2	Agilent	7131000
CUVETES do metacrilato do TIPO (PMMA), Semi-Micro Solução da	de BrandTech	759085D
Corning		354270
Sistemas do PCR do tempo real de CFX Opus	Bio-Rad	12011319
Chip	Emulate	N/A
Chip-S1 Stretchable Chip	Emulate	N/A
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046
Transparente,  48 poços	Corning	3548
Colágeno da placenta humana	Sigma-Aldrich	C5533
Colgenase, Tipo I, pó	Gibco	17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium com Kit	Cell Biologics	H-1168
Tubos de Centrífuga Cônicos de Polipropileno, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Tubos de Centrífuga Cônicos de Polipropileno, 50mL	Fisher Scientific	05-539-8
Lâminas de Câmara de Contagem de Células Countess	Invitrogen	C10283
Contador de células automatizado Countess II	Invitrogen
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Aniônico, Lisina Fixável	Invitrogen	D7132	Corante de permeabilidade
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Unidades de Filtro PES Descartáveis, membrana aPES de 0.2um	Fisher Scientific	FB12566504
DMEM/F-12	Gibco	11320033
Soro de burro	Sigma-Aldrich	D9663
Dulbecco′ s Águia Modificada′ s Glicose média - alta	Sigma-Aldrich	D5796
Dulbecco′ s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0	Corning	46-034-CI
ER-1 reagente de ativação de superfície Emulate		ER-1	Chip Activation Reagent 1
ER-2 reagent de ativação de superfície	Emular	ER-2	Chip Activation Reagent 2
Fibronectina Proteína Humana, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand  Placas de Petri com Tampa Transparente, 100mm	Fisher Scientific	FB0875713
de Revestimento à Base de Gelatina	Cell Biologics	6950
Genie Temp-Shaker 300	Scientific Industries, Inc.	SI-G300
Gentamicina	Gibco	15750060
HEPES, Solução Líquida 1M (238.3 mg/ mL)	Corning	25-060-CI
Hoechst 33342, Tricloridrato, Trihidrato	Invitrogen	H3570
Colágeno Humano Tipo I	Sigma-Aldrich	CC050
Células Endoteliais Microvasculares Primárias Humanas do Intestino Delgado	Celular Microscópio Invertido Cell Biologics	H-6054
Fisher	Scientific	03-000-013
Isotemp Banhos de Água Deluxe de Propósito Geral	Fisher Scientific	FSGPD10
L-Glutamina	Gibco	25030-081
Luria Broth (LB) ágar, Miller	Supelco	L3027
L-WRN Cells	Matrigel da American Type Culture Collection	CRL-3276
, sem LDEV	N-2 de Matriz de	Cultura de Células	Corning
(100x)	Gibco	17502048
N-acetil-L-cisteína	Sigma-Aldrich
LÂMPADA UV NAILSTAR	NailStar	NS-01-US
NanoDrop OneC  Espectrofotômetro UV-Vis de Microvolume	Thermo Scientific	840-274200
Módulo Hub Orb-HM1
Paraformaldeído	ThermoFisher	047392.9L
	Gibco	15140122
Phosphate tampoed salina (PBS)	Gibco	10010023
Pipet-Lite Multi Pipeta L8-200XLS+	Rainin	17013805
Ponteiras de Pipeta TR LTS 1000µ L S 768A/8	Rainin	17014966
Pod Módulo Portátil	Emular	N/A
Soro Fetal Bovino de Grau Premium (FBS)(Inativado pelo Calor)	QuantiTect Avantor Seradigm	1500-500
	QIAGEN	205313
Fator de Crescimento Epidérmico Murino Recombinante (EGF)	PeproTech	315-09
SB 431542	Tocris	1614
Prato de BioEnsaio Quadrado com Alças, não tratado com TC	Corning	431111
SsoAdvanced Universal SYBR  Tubo
Steriflip-GV	de Células Estéreis SE1M179M6		Millipore
, 70um	Fisher Scientific	22-363-548
, 10mL	Fisher Scientific	14-955-453
Tesoura de ponta reta, fina e afiada	Miltex  Instrumentos	MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrífuga	Thermo Scientific	75016052
Triton  X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Detergente
TRIzol Reagente	extração de RNA	Invitrogen	15596026
Solução de Azul de Tripano, 0,4% (p/v) em PBS, pH 7,5 ± 0,5	Corning	25-900-CI
(1X), sem vermelho de fenol	Gibco	12604013	reagente de dissociação enzimática
tripsina-EDTA Incubadora	Sigma-Aldrich	T4174
VIOS 160i, 165 L	Thermo Scientific	13-998-252
Y-27632	Tocris	1254
Zoë-CM1 Módulo de Cultura	Emular	N/A

recuperação da pilha Placas de Poços Múltiplos Tratadas com TC AMQAX1000 Solução Matriz de Membrana de Pouso Reduzida por Fator de Crescimento Suplemento 356231 1009005 Nicotinamida Sigma-Aldrich 72340 Emular N/A Penicilina-Estreptomicina Kit de Transcrição Reversa de Centrífuga Estéril 1725271 Supermix Verde Unidade de Filtro Superior Filtros Seringas Estéreis Reagente de Enzima TrypLE Express de Solução de de CO2