نموذج الموائع الدقيقة لالتهاب الأمعاء والقولون الناخر الذي يتضمن الأمعاء المعوية البشرية حديثي الولادة وميكروبيوم عسر الهضم
Summary
يصف هذا البروتوكول نموذجا في المختبر لالتهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC) ، والذي يمكن استخدامه للدراسات الميكانيكية في التسبب في المرض. يتميز بشريحة الموائع الدقيقة المصنفة بمعوية معوية مشتقة من الأمعاء الوليدية البشرية والخلايا البطانية والميكروبيوم المعوي لحديثي الولادة المصاب ب NEC الشديد.
Abstract
التهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC) هو مرض معوي شديد ومميت يصعب دراسته بسبب التسبب في المرض المعقد ، والذي لا يزال غير مفهوم بشكل كامل. تشمل الفيزيولوجيا المرضية ل NEC تعطيل الوصلات المعوية الضيقة ، وزيادة نفاذية حاجز الأمعاء ، وموت الخلايا الظهارية ، و dysbiosis الميكروبي ، والالتهاب غير المنظم. تشمل الأدوات التقليدية لدراسة NEC النماذج الحيوانية وخطوط الخلايا والكائنات العضوية المعوية البشرية أو الفأر. في حين أن الدراسات التي تستخدم هذه الأنظمة النموذجية قد حسنت فهم المجال للفيزيولوجيا المرضية للمرض ، فإن قدرتها على تلخيص تعقيد NEC البشري محدودة. تم الآن تطوير نموذج محسن في المختبر من NEC باستخدام تقنية الموائع الدقيقة ، يسمى NEC-on-a-chip. يتكون نموذج NEC-on-a-chip من جهاز ميكروفلويديك مبذر بمعوية معوية مشتقة من حديثي الولادة الخدج ، وتمت زراعته بشكل مشترك مع الخلايا البطانية البشرية والميكروبيوم من رضيع مصاب ب NEC شديد. هذا النموذج هو أداة قيمة للدراسات الميكانيكية في الفيزيولوجيا المرضية ل NEC ومورد جديد لاختبار اكتشاف الأدوية للأمراض المعوية الوليدية. في هذه المخطوطة ، سيتم تقديم وصف تفصيلي لنموذج NEC-on-a-chip.
Introduction
يؤثر التهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC) على الخدج ، مع حدوث ما يصل إلى 10٪ في أولئك الذين يولدون بوزن < 1500 جم1. الفيزيولوجيا المرضية ل NEC معقدة وتشمل تلف ظهارة الأمعاء ، وتعطيل الوصلات المعوية الضيقة ، وزيادة نفاذية حاجز الأمعاء ، وعدم التنظيم المناعي ، وموت الخلايا الظهارية 2,3. لا يزال فهمنا للآليات التي ينطوي عليها التسبب في NEC غير مكتمل ، وعلى الرغم من عقود من البحث ، لا توجد حتى الآن علاجات مستهدفة فعالة.
يتمثل أحد العوائق الكبيرة التي تحول دون تقدم أبحاث NEC في التوافر المحدود وصغر حجم الأنسجة المعوية الأولية المعزولة عن الأطفال الرضع. غالبا ما تكون الأنسجة المعوية التي يتم استئصالها من الرضع المصابين ب NEC نخرية ومتضررة بشدة ، مما يعقد الدراسات حول الآليات التي تسبق ظهور المرض. على سبيل المثال ، تغمر الأمعاء الدقيقة للرضع المصابين ب NEC بالخلايا المناعية ، كما لوحظ انخفاض عدد الخلايا الجذعية المعوية ، وانخفاض تكاثر الخلايا الظهارية ، وزيادة موت الخلايا المبرمجللخلايا الظهارية 4،5،6،7. هذا يؤدي إلى صعوبات في زراعة الخلايا الظهارية المعوية من هذه العينات وفي عزل الحمض النووي الريبي والبروتينات ، والتي يمكن أن تتحلل في هذه البيئة الالتهابية المعادية. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن عملية المرض متقدمة بالفعل عند الرضع الذين يعانون من NEC الجراحي ، فإن الدراسات الميكانيكية في العوامل التي تحفز المرض غير مجدية. وقد أدت هذه القيود إلى الاعتماد على النماذج الحيوانية للدراسات الميكانيكية ل NEC.
تم إنشاء نماذج حيوانية من NEC للفئران والجرذان والخنازير والأرانب وقردة البابون5،8،9،11. تتمثل قوة النماذج الحيوانية في أن المرض المعوي الشبيه ب NEC ناتج عن عوامل مرتبطة بظهور NEC في البشر ، بما في ذلك ميكروبيوم dysbiotic ، ونوبات متكررة من نقص الأكسجة ، وغياب حليب الثدي يغذي5،8،10،11. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاستجابة الالتهابية والتغيرات المرضية التي لوحظت خلال NEC التجريبية توازي المرض البشري5،9،12. في حين أن هذه النماذج تحاكي العديد من ميزات NEC البشرية ، إلا أن هناك اختلافات متأصلة بين الفيزيولوجيا المرضية ل NEC في الحيوانات والبشر. على سبيل المثال ، يتم تحفيز نموذج الفئران من NEC في الفئران المولودة على المدى الكامل ، وعلى الرغم من أن نموها المعوي غير مكتمل ، إلا أن الفيزيولوجيا المرضية ل NEC مختلفة بطبيعتها في هذا السياق السريري. يشبه التعبير الجيني المعوي للفئران عند الولادة الجنين البشري القابل للحياة مسبقا ولا يقترب من حديث الولادة المبتسر من 22-24 أسبوعا من الحمل حتى اليوم 14 (P14) 13. هذا يربك نموذج الفئران NEC لأنه لا يمكن إحداث إصابة معوية بشكل عام في الفئران بعد P10. بالإضافة إلى ذلك ، تفتقر سلالات الفئران الفطرية إلى التنوع المناعي14 والتنوع الميكروبيولوجي لحديثي الولادةمن البشر 15 ، والذي يعمل كعامل مربك آخر. وبالتالي ، فإن زيادة دمج العينات البشرية الأولية في أبحاث NEC يحسن الأهمية السريرية للدراسات في هذا المجال.
استخدمت الدراسات حول آليات NEC في المختبر تقليديا خطوط الخلايا أحادية النمط المشتقة من خلايا سرطان الأمعاء البالغة ، مثل سرطان القولون والمستقيم الغدي (Caco2) وسرطان القولون الغدي البشري (HT-29)الخلايا 16. هذه النماذج مريحة ولكنها محدودة في الأهمية الفسيولوجية بسبب نموها من الخلايا السرطانية البالغة ، والبنية غير المستقطبة ، والتغيرات الظاهرية المتعلقة بالمقاطع المتكررة في الثقافة. تعمل الأمعاء المعوية على تحسين تلك النماذج حيث يمكن زراعتها من خبايا الأنسجة المعوية ، وتمييزها إلى جميع الأنواع الفرعية الظهارية المعوية ، وتشكيل بنية ثلاثية الأبعاد (3D) تشبه الزغابات17،18،19،20. في الآونة الأخيرة ، تم دمج المعوية المعوية مع تقنية الموائع الدقيقة لتطوير نموذج الأمعاء الدقيقة على رقاقة وتوفير نظام نموذج أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية في المختبر 21.
تم إدخال أجهزة الموائع الدقيقة الأولية للجهاز على رقاقة في أوائلعام 2000 22،23،24. كان أول نموذج للعضو على رقاقة هو الرئة البشرية التي تتنفس على رقاقة25. تبع ذلك العديد من نماذج العضو الواحد مثل الأمعاء21 والكبد 26 والكلى 27 ونخاع العظام 28 والحاجز الدموي الدماغي 29 والقلب30. تم استخدام نماذج الأعضاء على الرقاقة هذه لدراسة الأمراض الحادة والمزمنة والنادرة ، بما في ذلك متلازمة الإشعاع الحاد ،31 ومرض الانسداد الرئوي المزمن ،32 والأمراض التنكسية العصبية 33. تسمح الطبيعة المستقطبة للخلايا الموجودة على هذه الرقائق ووجود مقصورتين خلويتين مفصولتين بغشاء مسامي بنمذجة العمليات الفسيولوجية المعقدة مثل التروية وتدرجات التركيز الكيميائي للخلايا المناعية34,35. وبالتالي توفر أنظمة الموائع الدقيقة هذه أداة جديدة لدراسة الفيزيولوجيا المرضية وآليات الأمراض البشرية.
تم وصف نموذج الأمعاء الدقيقة على رقاقة بواسطة Kasendra et al. في عام 2018 ، الذين استخدموا عينات خزعة معوية صغيرة للأطفال (تتراوح أعمارهم بين 10 و 14 عاما) متباينة إلى معوية ومستزرعة على جهاز الموائع الدقيقة21. كما تم دمج الخلايا البطانية الوعائية ، وتدفق الوسائط المستمر ، والتمدد / الاسترخاء في هذا النموذج. لاحظوا تمايز النوع الفرعي الظهاري المعوي ، وتشكيل محاور تشبه الزغابات 3D ، وإنتاج المخاط ، وأنماط التعبير الجيني المعوي الصغير21. تم تطبيق نموذج الموائع الدقيقة هذا على أمراض حديثي الولادة مع تطوير نظام NEC-on-a-chip ، والذي يتضمن الأمعاء المعوية لحديثي الولادة والخلايا البطانية والميكروبيوم من حديث الولادة مع NEC36. يلخص NEC-on-a-chip العديد من السمات الهامة ل NEC البشري ، بما في ذلك التعبير الجيني الالتهابي ، وفقدان الخلايا الظهارية المتخصصة ، وانخفاض وظيفة حاجز الأمعاء36. وبالتالي ، فإن هذا النموذج له العديد من التطبيقات في دراسة NEC ، بما في ذلك الدراسات الميكانيكية واكتشاف الأدوية. في هذه المخطوطة ، يتم توفير بروتوكول مفصل لأداء نموذج NEC-on-a-chip.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد نظام NEC-on-a-chip أداة جديدة قوية يمكن استخدامها لنمذجة الفيزيولوجيا المرضية ل NEC. توفر هذه المنصة بيئة دقيقة معقدة تشبه إلى حد كبير الوسط المعوي في الجسم الحي أكثر من النماذج السابقة من خلال دمج نظام الاستزراع المشترك مع التدفق اللمعي المستمر والتمدد. تعزز هذه الظروف تطوير بنية تشبه ا…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه المخطوطة من قبل R01DK118568 (MG) و R01DK124614 (MG) و R01HD105301 (MG) من المعاهد الوطنية للصحة ، ومنحة مبادرة تشان زوكربيرج 2022-316749 (MG) ، وجائزة Thrasher Research Fund Early Career Award (LCF) ، ومنحة الباحث الوظيفي المبكر لتنمية الأطفال في UNC (LCF) من خلال الدعم السخي من المانحين لجامعة نورث كارولينا في تشابل هيل ، وقسم طب الأطفال في جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل.
Materials
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| A 83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Gibco | 12634010 | |
| B-27 Supplement, serum free (50x) | Gibco | 17504044 | |
| Basic Bio-kit | Emulate | N/A | |
| BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | Agilent | 7131000 | |
| BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro | BrandTech | 759085D | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| CFX Opus Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chip Cradle | Emulate | N/A | |
| Chip-S1 Stretchable Chip | Emulate | N/A | |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates, 48 well | Corning | 3548 | |
| Collagen from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
| Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit | Cell Biologics | H-1168 | |
| Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess II automated cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Invitrogen | D3571 | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7132 | Permeability dye |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane | Fisher Scientific | FB12566504 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | Corning | 46-034-CI | |
| ER-1 surface activation reagent | Emulate | ER-1 | Chip Activation Reagent 1 |
| ER-2 surface activation reagent | Emulate | ER-2 | Chip Activation Reagent 2 |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics | 6950 | |
| Genie Temp-Shaker 300 | Scientific Industries, Inc. | SI-G300 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | |
| HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) | Corning | 25-060-CI | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Invitrogen | H3570 | |
| Human Collagen Type I | Sigma-Aldrich | CC050 | |
| Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells | Cell Biologics | H-6054 | |
| Inverted Microscope | Fisher Scientific | 03-000-013 | |
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Broth (LB) agar, Miller | Supelco | L3027 | |
| L-WRN Cells | American Type Culture Collection | CRL-3276 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356231 | Cell Culture Matrix |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | 1009005 | |
| NAILSTAR UV LAMP | NailStar | NS-01-US | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-274200 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | 72340 | |
| Orb-HM1 Hub Module | Emulate | N/A | |
| Paraformaldehyde | ThermoFisher | 047392.9L | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | |
| Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 | Rainin | 17014966 | |
| Pod Portable Module | Emulate | N/A | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated) | Avantor Seradigm | 1500-500 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated | Corning | 431111 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
| Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SE1M179M6 | |
| Sterile Cell Strainers, 70um | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Sterile Syringes, 10mL | Fisher Scientific | 14-955-453 | |
| Straight, fine, sharp point scissors | Miltex Instruments | MH5-300 | |
| Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge | Thermo Scientific | 75016052 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Detergent |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | RNA extraction reagent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 | Corning | 25-900-CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12604013 | Enzymatic Dissociation Reagent |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L | Thermo Scientific | 13-998-252 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| Zoë-CM1 Culture Module | Emulate | N/A |
Referências
- Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis. BMC Pediatrics. 20 (1), 344 (2020).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
- Frazer, L. C., Good, M. Intestinal epithelium in early life. Mucosal Immunology. 15 (6), 1181-1187 (2022).
- Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2′-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. The British Journal of Nutrition. 116 (7), 1175-1187 (2016).
- Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. Methods in Molecular Biology. 2321, 101-110 (2021).
- Afrazi, A., et al. Toll-like receptor 4-mediated endoplasmic reticulum stress in intestinal crypts induces necrotizing enterocolitis. The Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9584-9599 (2014).
- Neal, M. D., et al. Toll-like receptor 4 is expressed on intestinal stem cells and regulates their proliferation and apoptosis via the p53 up-regulated modulator of apoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37296-37308 (2012).
- Sodhi, C., Richardson, W., Gribar, S., Hackam, D. J. The development of animal models for the study of necrotizing enterocolitis. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 94-98 (2008).
- Ares, G. J., McElroy, S. J., Hunter, C. J. The science and necessity of using animal models in the study of necrotizing enterocolitis. Seminars in pediatric surgery. 27 (1), 29-33 (2018).
- Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
- Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocol. 2 (4), 100951 (2021).
- Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
- Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. 88 (1), 66-76 (2020).
- Noll, K. E., Ferris, M. T., Heise, M. T. The Collaborative Cross: A Systems Genetics Resource for Studying Host-Pathogen Interactions. Cell Host Microbe. 25 (4), 484-498 (2019).
- Ericsson, A. C., Franklin, C. L. The gut microbiome of laboratory mice: considerations and best practices for translational research. Mammalian Genome. 32 (4), 239-250 (2021).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing Enterocolitis: Overview on In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 2871 (2018).
- Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
- Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
- Sung, J. H., Shuler, M. L. A micro cell culture analog (microCCA) with 3-D hydrogel culture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity of anti-cancer drugs. Lab Chip. 9 (10), 1385-1394 (2009).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Jang, K. J., et al. Reproducing human and cross-species drug toxicities using a Liver-Chip. Science translational medicine. 11 (517), eaax5516 (2019).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature biomedical engineering. 1, 0069 (2017).
- Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature biomedical engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
- Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
- Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
- Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Modeling radiation injury-induced cell death and countermeasure drug responses in a human Gut-on-a-Chip. Cell Death & Disease. 9 (2), 223 (2018).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. On-chip 3D neuromuscular model for drug screening and precision medicine in neuromuscular disease. Nature Protocols. 15 (2), 421-449 (2020).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
- Xiang, Y., et al. Gut-on-chip: Recreating human intestine in vitro. Journal of tissue engineering. 11, 2041731420965318 (2020).
- Lanik, W. E., et al. Microfluidic device facilitates in vitro modeling of human neonatal necrotizing enterocolitis-on-a-chip. JCI Insight. 8 (8), e146496 (2023).
- Emulate. . Duodenum Intestine-Chip Protocol. , (2022).
- Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus HN001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: evidence in mice for a role of TLR9 . American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
- JoVE Science Education Database. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. JoVE. , (2023).
- VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
