Modèle microfluidique d’entérocolite nécrosante incorporant des entéroïdes intestinaux néonatals humains et un microbiome dysbiotique

Summary

Ce protocole décrit un modèle in vitro d’entérocolite nécrosante (NEC), qui peut être utilisé pour des études mécanistiques de la pathogenèse de la maladie. Il est doté d’une puce microfluidique ensemencée d’entéroïdes intestinaux dérivés de l’intestin néonatal humain, de cellules endothéliales et du microbiome intestinal d’un nouveau-né atteint d’une NEC sévère.

Abstract

L’entérocolite nécrosante (ECN) est une maladie intestinale grave et potentiellement mortelle qui a été difficile à étudier en raison de sa pathogenèse complexe, qui reste incomplètement comprise. La physiopathologie de la NEC comprend la perturbation des jonctions serrées intestinales, l’augmentation de la perméabilité de la barrière intestinale, la mort des cellules épithéliales, la dysbiose microbienne et l’inflammation déréglée. Les outils traditionnels pour étudier la NEC comprennent des modèles animaux, des lignées cellulaires et des organoïdes intestinaux humains ou murins. Bien que les études utilisant ces systèmes modèles aient amélioré la compréhension de la physiopathologie de la maladie, leur capacité à récapituler la complexité de la NEC humaine est limitée. Un modèle in vitro amélioré de NEC utilisant la technologie microfluidique, appelé NEC-on-a-chip, a maintenant été développé. Le modèle NEC-on-a-chip consiste en un dispositif microfluidique ensemencé avec des entéroïdes intestinaux dérivés d’un nouveau-né prématuré, co-cultivé avec des cellules endothéliales humaines et le microbiome d’un nourrisson atteint d’une NEC sévère. Ce modèle est un outil précieux pour les études mécanistiques sur la physiopathologie de la NEC et une nouvelle ressource pour les tests de découverte de médicaments pour les maladies intestinales néonatales. Dans ce manuscrit, une description détaillée du modèle NEC-on-a-chip sera fournie.

Introduction

L’entérocolite nécrosante (ECN) touche les prématurés, avec une incidence allant jusqu’à 10 % chez ceux nés pesant < 1500 g¹. La physiopathologie de la NEC est complexe et comprend des lésions de l’épithélium intestinal, une perturbation des jonctions intestinales serrées, une augmentation de la perméabilité de la barrière intestinale, un dérèglement immunitaire et la mort des cellules épithéliales ^2,3. Notre compréhension des mécanismes impliqués dans la pathogenèse de la NEC reste incomplète et, malgré des décennies de recherche, il n’existe toujours pas de thérapies ciblées efficaces.

L’un des principaux obstacles à l’avancement de la recherche sur la NEC est la disponibilité limitée et la petite taille des tissus intestinaux primaires isolés chez les nourrissons humains. Les tissus intestinaux réséqués chez les nourrissons atteints d’ECN sont souvent nécrotiques et gravement endommagés, ce qui complique les études sur les mécanismes qui précèdent l’apparition de la maladie. Par exemple, l’intestin grêle des nourrissons atteints d’ECN est inondé de cellules immunitaires, et un nombre réduit de cellules souches intestinales, une diminution de la prolifération des cellules épithéliales et une augmentation de l’apoptose des cellules épithéliales sont également observés 4,5,6,7. Cela entraîne des difficultés à cultiver les cellules épithéliales intestinales à partir de ces échantillons et à isoler l’ARN et les protéines, qui peuvent être dégradés dans cet environnement inflammatoire hostile. De plus, étant donné que le processus de la maladie est déjà avancé chez les nourrissons atteints d’une NEC chirurgicale, les études mécanistiques sur les facteurs qui induisent la maladie sont impossibles. Ces limitations ont conduit à une dépendance à l’égard de modèles animaux pour les études mécanistiques de la NEC.

Des modèles animaux de NEC ont été établis pour les souris, les rats, les porcelets, les lapins et les babouins 5,8,9,11. L’un des points forts des modèles animaux est que la maladie intestinale de type NEC est induite par des facteurs associés à l’apparition de NEC chez l’homme, notamment un microbiome dysbiotique, des épisodes répétés d’hypoxie et l’absence d’allaitement au lait maternel 5,8,10,11. De plus, la réponse inflammatoire et les changements pathologiques observés au cours de la NEC expérimentale sont parallèles à la maladie humaine ^5,9,12. Bien que ces modèles imitent de nombreuses caractéristiques de la NEC humaine, il existe des différences inhérentes entre la physiopathologie de la NEC chez les animaux et les humains. Par exemple, le modèle murin de NEC est induit chez des souris nées à terme, et bien que leur développement intestinal soit incomplet, la physiopathologie de NEC est intrinsèquement différente dans ce contexte clinique. L’expression des gènes intestinaux murins à la naissance est similaire à celle d’un fœtus humain préviable et ne se rapproche pas de celle d’un nouveau-né prématuré de 22 à 24 semaines de gestation jusqu’au jour 14 (P14)¹³. Cela confond le modèle NEC murin parce que les lésions intestinales ne peuvent généralement pas être induites chez les souris après P10. De plus, les souches consanguines de souris n’ont pas la diversité immunologique¹⁴ et microbiologique des nouveau-nés humains¹⁵, ce qui constitue un autre facteur de confusion. Ainsi, l’incorporation accrue d’échantillons humains primaires dans la recherche NEC améliore la pertinence clinique des études dans ce domaine.

Les études sur les mécanismes de la NEC in vitro ont traditionnellement utilisé des lignées cellulaires monotypiques dérivées de cellules cancéreuses intestinales adultes, telles que les cellules d’adénocarcinome colorectal (Caco2) et d’adénocarcinome du côlon humain (HT-29)¹⁶. Ces modèles sont pratiques, mais limités en pertinence physiologique en raison de leur croissance à partir de cellules cancéreuses adultes, de leur architecture non polarisée et des changements phénotypiques liés à des passages répétés en culture. Les entéroïdes intestinaux améliorent ces modèles puisqu’ils peuvent être cultivés à partir des cryptes du tissu intestinal, différenciés en tous les sous-types épithéliaux intestinaux et former une structure tridimensionnelle (3D) semblable à des villosités^17,18,19,20. Récemment, les entéroïdes intestinaux ont été combinés à la technologie microfluidique pour développer un modèle d’intestin grêle sur puce et fournir un système modèle in vitro plus pertinent sur le plan physiologique²¹.

Les premiers dispositifs microfluidiques d’organes sur puce ont été introduits au début des années^{2000 22,23,24}. Le premier modèle d’organe sur puce était le poumon sur puce à respiration humaine²⁵. Il a été suivi par de nombreux modèles mono-organes tels que l’intestin 21, le foie 26, les reins 27, la moelle osseuse 28, la barrière hémato-encéphalique ²⁹ et le cœur³⁰. Ces modèles d’organes sur puce ont été utilisés pour étudier les maladies aiguës, chroniques et rares, notamment le syndrome d’irradiation ^aiguë31, la bronchopneumopathie chronique ^{obstructive32} et les maladies neurodégénératives³³. La nature polarisée des cellules sur ces puces et la présence de deux compartiments cellulaires séparés par une membrane poreuse permettent de modéliser des processus physiologiques complexes tels que la perfusion, les gradients de concentration chimique et la chimiotaxie des cellules immunitaires^34,35. Ces systèmes microfluidiques constituent ainsi un nouvel outil pour l’étude de la physiopathologie et des mécanismes des maladies humaines.

Le modèle de l’intestin grêle sur puce a été décrit par Kasendra et al. en 2018, qui ont utilisé des échantillons de biopsie de l’intestin grêle pédiatriques (âgés de 10 à 14 ans) différenciés en entéroïdes et cultivés sur un dispositif microfluidique²¹. Les cellules endothéliales vasculaires, l’écoulement continu des milieux et l’étirement/relaxation ont également été incorporés dans ce modèle. Ils ont observé la différenciation des sous-types épithéliaux intestinaux, la formation d’axes 3D en forme de villosités, la production de mucus et les modèles d’expression des gènes de l’intestin grêle²¹. Ce modèle microfluidique a été appliqué aux maladies néonatales avec le développement du système NEC-on-a-chip, qui intègre les entéroïdes intestinaux néonatals, les cellules endothéliales et le microbiome d’un nouveau-né atteint de NEC³⁶. La NEC sur puce récapitule de nombreuses caractéristiques essentielles de la NEC humaine, notamment l’expression des gènes inflammatoires, la perte de cellules épithéliales spécialisées et la réduction de la fonction de barrière intestinale³⁶. Ainsi, ce modèle a de nombreuses applications dans l’étude de la NEC, y compris les études mécanistiques et la découverte de médicaments. Dans ce manuscrit, un protocole détaillé pour les performances du modèle NEC-on-a-chip est fourni.

Protocol

Les entéroïdes ont été obtenus à partir d’échantillons de l’intestin grêle de nourrissons prématurés (nés entre 22 et 36 semaines de gestation) obtenus au moment de la chirurgie pour une NEC ou d’autres affections intestinales d’étiologies non inflammatoires. Tous les prélèvements et traitements d’échantillons ont été effectués après le consentement éclairé et l’approbation des comités d’examen institutionnels de l’Université Washington à St. Louis (numéros de protocole 201706182 e…

Representative Results

Des entéroïdes ont été ensemencés sur le dispositif microfluidique (Figure 1) et mis en culture comme décrit ci-dessus. La croissance des entéroïdes dans l’hydrogel de la matrice de culture cellulaire avant l’ensemencement, puis l’expansion subséquente de la monocouche de cellules épithéliales intestinales après l’ensemencement du dispositif ont été surveillées par microscopie à fond clair (Figure 2). Une monocouche de cellules épithéli…

Discussion

Ce système NEC-on-a-chip est un nouvel outil puissant qui peut être utilisé pour modéliser la physiopathologie de la NEC. Cette plate-forme fournit un microenvironnement complexe qui ressemble plus étroitement au milieu intestinal in vivo que les modèles précédents en incorporant un système de co-culture avec un flux luminal continu et un étirement. Ces conditions favorisent le développement d’une architecture 3D en forme de villosités tapissée d’un épithélium hautement polarisé constitué de…

Materials

[Leu15]-Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145
A 83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Gibco	12634010
B-27 Supplement, serum free (50x)	Gibco	17504044
Basic Bio-kit	Emulate	N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader	Agilent	7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro	BrandTech	759085D
Cell Recovery Solution	Corning	354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems	Bio-Rad	12011319
Chip Cradle	Emulate	N/A
Chip-S1 Stretchable Chip	Emulate	N/A
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well	Corning	3548
Collagen from human placenta	Sigma-Aldrich	C5533
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit	Cell Biologics	H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL	Fisher Scientific	05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
Countess II automated cell counter	Invitrogen	AMQAX1000
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable	Invitrogen	D7132	Permeability dye
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane	Fisher Scientific	FB12566504
DMEM/F-12	Gibco	11320033
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – high glucose	Sigma-Aldrich	D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0	Corning	46-034-CI
ER-1 surface activation reagent	Emulate	ER-1	Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent	Emulate	ER-2	Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm	Fisher Scientific	FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics	6950
Genie Temp-Shaker 300	Scientific Industries, Inc.	SI-G300
Gentamicin	Gibco	15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL)	Corning	25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Invitrogen	H3570
Human Collagen Type I	Sigma-Aldrich	CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Biologics	H-6054
Inverted Microscope	Fisher Scientific	03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths	Fisher Scientific	FSGPD10
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller	Supelco	L3027
L-WRN Cells	American Type Culture Collection	CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	356231	Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502048
N-acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	1009005
NAILSTAR UV LAMP	NailStar	NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-274200
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	72340
Orb-HM1 Hub Module	Emulate	N/A
Paraformaldehyde	ThermoFisher	047392.9L
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Rainin	17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8	Rainin	17014966
Pod Portable Module	Emulate	N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)	Avantor Seradigm	1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit	QIAGEN	205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)	PeproTech	315-09
SB 431542	Tocris	1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated	Corning	431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit	Millipore	SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um	Fisher Scientific	22-363-548
Sterile Syringes, 10mL	Fisher Scientific	14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors	Miltex Instruments	MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge	Thermo Scientific	75016052
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Detergent
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596026	RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5	Corning	25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L	Thermo Scientific	13-998-252
Y-27632	Tocris	1254
Zoë-CM1 Culture Module	Emulate	N/A