このプロトコルは病気の病因に機構の調査に使用することができる壊死性腸炎(NEC)の 生体外の モデルを記述する。ヒト新生児の腸、内皮細胞、および重度のNECの新生児の腸内細菌叢に由来する腸内エンテロイドをシードしたマイクロ流体チップを特徴としています。
壊死性腸炎(NEC)は、重篤で致命的な可能性のある腸疾患であり、その複雑な病因のために研究が困難であり、完全には理解されていません。NECの病態生理には、腸管タイトジャンクションの破壊、腸管バリア透過性の増加、上皮細胞死、微生物嚥下障害、および調節不全炎症が含まれます。NECを研究するための従来のツールには、動物モデル、細胞株、ヒトまたはマウスの腸管オルガノイドが含まれます。これらのモデルシステムを用いた研究は、疾患の病態生理学に関するこの分野の理解を深めてきましたが、ヒトNECの複雑さを再現する能力は限られています。現在、マイクロ流体技術を用いたNECの改良型in vitro モデル「NEC-on-a-chip」が開発されています。NEC-on-a-chipモデルは、早産児由来の腸管エンテロイドを播種し、ヒト内皮細胞と重症NEC乳児のマイクロバイオームを共培養したマイクロ流体デバイスで構成されています。このモデルは、NECの病態生理機構を研究するための貴重なツールであり、新生児腸疾患の創薬試験のための新しいリソースです。本稿では、NEC-on-a-chipモデルについて詳細に説明する。
壊死性腸炎(NEC)は早産児に影響を及ぼし、体重が1500g<生まれた乳児の発生率は最大10%です1。NECの病態生理は複雑で、腸管上皮の損傷、腸管タイトジャンクションの破壊、腸管バリア透過性の増加、免疫調節不全、上皮細胞死などが含まれます2,3。NECの発症機序の解明は未だに不完全であり、何十年にもわたる研究にもかかわらず、有効な標的療法は未だに存在しません。
NECの研究を進める上での大きな障壁は、ヒトの乳児から分離された一次腸組織が限られていることとサイズが小さいことです。NECの乳児から切除された腸組織は、しばしば壊死し、重度の損傷を受けるため、疾患発症に先行するメカニズムの研究は複雑です。例えば、NECの乳児の小腸には免疫細胞が氾濫し、腸管幹細胞の減少、上皮細胞の増殖の減少、上皮細胞のアポトーシスの増加も観察されます4,5,6,7。これにより、これらのサンプルから腸管上皮細胞を培養したり、この敵対的な炎症環境で分解される可能性のあるRNAやタンパク質を単離することが困難になります。さらに、外科的NECの乳児ではすでに疾患プロセスが進行しているため、疾患を誘発する要因のメカニズム研究は実行不可能です。これらの制限により、NECのメカニズム研究は動物モデルに依存しています。
NECの動物モデルは、マウス、ラット、子豚、ウサギ、ヒヒについて確立されています5,8,9,11。動物モデルの強みは、細菌叢様マイクロバイオーム、低酸素症の繰り返し、母乳育児の欠如など、ヒトのNEC発症に関連する要因によってNEC様腸疾患が誘発されることである5,8,10,11。さらに、実験中に観察された炎症反応と病理学的変化NECパラレルヒト疾患5,9,12。これらのモデルはヒトNECの特徴の多くを模倣しているが、動物とヒトにおけるNECの病態生理には本質的な違いがある。例えば、正期産のマウスモデルNECは、正期産のマウスに誘導され、腸管の発達は不完全であるが、NECの病態生理は、この臨床の文脈では本質的に異なっている。出生時のマウスの腸内遺伝子発現は、生存前のヒト胎児に類似しており、妊娠22〜24週の早産児の14日目まで近似しない(P14)13。これは、P10以降のマウスでは腸の損傷を一般的に誘発できないため、マウスNECモデルを混乱させます。さらに、近交系マウスはヒト新生児の免疫学的多様性14と微生物学的多様性を欠いており15、これも交絡因子として機能している。したがって、NECの研究への一次ヒトサンプルの組み込みを増やすことで、この分野の研究の臨床的関連性が向上します。
NECのin vitroでのメカニズムの研究は、従来、大腸腺癌(Caco2)細胞やヒト結腸腺癌(HT-29)細胞などの成人腸癌細胞に由来する単型細胞株を利用してきました16。これらのモデルは簡便であるが、成体がん細胞からの増殖、非分極構造、および培養の反復継代に関連する表現型の変化により、生理学的関連性が限られている。腸管内エンテロイドは、腸組織の陰窩から成長し、すべての腸上皮サブタイプに分化し、3次元(3D)の絨毛様構造を形成することができるため、これらのモデルを改良します17,18,19,20。最近、腸管内エンテロイドは、小腸オンチップモデルを開発し、より生理学的に関連性のあるin vitroモデルシステムを提供するために、マイクロ流体技術と組み合わされている21。
最初の臓器チップマイクロ流体デバイスは、2000年代初頭に導入されました22,23,24。最初の臓器チップモデルは、ヒトの呼吸肺チップ25であった。これに続いて、腸21、肝臓26、腎臓27、骨髄28、血液脳関門29、心臓30など、多数の単一臓器モデルが続いた。これらのOrgan-on-a-chipモデルは、急性放射線症候群31、慢性閉塞性肺疾患32、神経変性疾患33などの急性疾患、慢性疾患、希少疾患の研究に用いられている。これらのチップ上の細胞の分極された性質と、多孔質膜で隔てられた2つの細胞区画の存在により、灌流、化学濃度勾配、免疫細胞走化性などの複雑な生理学的プロセスのモデリングが可能になります34,35。したがって、これらのマイクロ流体システムは、ヒト疾患の病態生理学とメカニズムを研究するための新しいツールを提供します。
小腸オンチップモデルは、2018年にKaserdraらによって記述され、小児(10〜14歳)の小腸生検標本をエンテロイドに分化させ、マイクロ流体デバイスで培養しました21。血管内皮細胞、連続培地の流れ、および伸張/弛緩もこのモデルに組み込まれました。彼らは、腸上皮サブタイプの分化、3D絨毛様軸の形成、粘液産生、および小腸の遺伝子発現パターンを観察しました21。このマイクロ流体モデルは、新生児の腸管エンテロイド、内皮細胞、およびNEC36を持つ新生児のマイクロバイオームを組み込んだNEC-on-a-chipシステムの開発により、新生児疾患に適用されました。NEC-on-a-chipは、炎症性遺伝子発現、特殊な上皮細胞の喪失、腸管バリア機能の低下など、ヒトNECの重要な特徴の多くを再現している36。このように、このモデルは、機構研究や創薬など、NECの研究において多くの応用が期待されています。この原稿では、NEC-on-a-chipモデルの性能に関する詳細なプロトコルを提供します。
このNEC-on-a-chipシステムは、NECの病態生理学をモデル化するために使用できる強力な新しいツールです。このプラットフォームは、連続的な管腔の流れとストレッチを備えた共培養システムを組み込むことにより、以前のモデルよりも in vivo 腸環境によく似た複雑な微小環境を提供します。これらの条件は、成熟した上皮サブタイプとタイトジャンクションからなる高度に分極された上…
The authors have nothing to disclose.
この原稿は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校への寄付者の寛大な支援を通じて、米国国立衛生研究所のR01DK118568(MG)、R01DK124614(MG)、およびR01HD105301(MG)、Chan Zuckerberg Initiative Grant 2022-316749(MG)、Thrasher Research Fund Early Career Award(LCF)、UNC Children’s Development Early Career Investigator Grant(LCF)の支援を受けました。 ノースカロライナ大学チャペルヒル校の小児科。
[Leu15]-Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145 | |
A 83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Gibco | 12634010 | |
B-27 Supplement, serum free (50x) | Gibco | 17504044 | |
Basic Bio-kit | Emulate | N/A | |
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | Agilent | 7131000 | |
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro | BrandTech | 759085D | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
CFX Opus Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | 12011319 | |
Chip Cradle | Emulate | N/A | |
Chip-S1 Stretchable Chip | Emulate | N/A | |
CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | |
Clear TC-treated Multiple Well Plates, 48 well | Corning | 3548 | |
Collagen from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit | Cell Biologics | H-1168 | |
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
Countess II automated cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Invitrogen | D3571 | |
DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7132 | Permeability dye |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane | Fisher Scientific | FB12566504 | |
DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-136 | |
EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | Corning | 46-034-CI | |
ER-1 surface activation reagent | Emulate | ER-1 | Chip Activation Reagent 1 |
ER-2 surface activation reagent | Emulate | ER-2 | Chip Activation Reagent 2 |
Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics | 6950 | |
Genie Temp-Shaker 300 | Scientific Industries, Inc. | SI-G300 | |
Gentamicin | Gibco | 15750060 | |
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) | Corning | 25-060-CI | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Invitrogen | H3570 | |
Human Collagen Type I | Sigma-Aldrich | CC050 | |
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells | Cell Biologics | H-6054 | |
Inverted Microscope | Fisher Scientific | 03-000-013 | |
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Luria Broth (LB) agar, Miller | Supelco | L3027 | |
L-WRN Cells | American Type Culture Collection | CRL-3276 | |
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356231 | Cell Culture Matrix |
N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | 1009005 | |
NAILSTAR UV LAMP | NailStar | NS-01-US | |
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-274200 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | 72340 | |
Orb-HM1 Hub Module | Emulate | N/A | |
Paraformaldehyde | ThermoFisher | 047392.9L | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | |
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 | Rainin | 17014966 | |
Pod Portable Module | Emulate | N/A | |
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated) | Avantor Seradigm | 1500-500 | |
QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
SB 431542 | Tocris | 1614 | |
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated | Corning | 431111 | |
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SE1M179M6 | |
Sterile Cell Strainers, 70um | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
Sterile Syringes, 10mL | Fisher Scientific | 14-955-453 | |
Straight, fine, sharp point scissors | Miltex Instruments | MH5-300 | |
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge | Thermo Scientific | 75016052 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Detergent |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | RNA extraction reagent |
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 | Corning | 25-900-CI | |
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12604013 | Enzymatic Dissociation Reagent |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L | Thermo Scientific | 13-998-252 | |
Y-27632 | Tocris | 1254 | |
Zoë-CM1 Culture Module | Emulate | N/A |