Nous présentons ici un protocole permettant d’isoler et d’identifier les cellules de niche limbique humaines.
Nous rapportons ici une procédure standard pour l’isolement et l’identification des cellules de niche limbique (LNC). Le tissu limbique obtenu à partir d’une banque d’yeux a été utilisé pour l’isolement des LNC. Le tissu a été divisé en 12 morceaux dans des conditions aseptiques et digéré pendant 18 h à 37 °C dans l’incubateur de culture cellulaire à l’aide de la collagénase A pour obtenir des amas cellulaires avec des LNC et des cellules progénitrices de l’épithélium limbique. Les amas de cellules ont ensuite été digérés pendant 15 minutes à 37 °C en utilisant 0,25 % de trypsine-EDTA pour obtenir des cellules individuelles, puis cultivés dans un milieu de cellules souches embryonnaires modifiées (MESCM) sur une surface plastique recouverte de 5 % de Matrigel. Les cellules ont été transmises à 70 % de confluence, et les LNC ont été identifiés à l’aide de l’immunofluorescence, de la PCR quantitative en temps réel (qPCR) et de la cytométrie en flux. Les LNC primaires ont été isolés et sont passés plus de 12 fois. L’activité de prolifération des LNC de P4 à P6 a été la plus élevée. Les LNC ont exprimé des marqueurs de cellules souches plus élevés que les BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR et PDGFRβ). De plus, les résultats ont montré que les LNC P4 exprimaient uniformément VIM, CD90, CD105 et PDGFRβ, mais pas Pan-CK, qui pourrait être utilisé comme marqueur pour l’identification des LNC. L’analyse par cytométrie en flux a montré qu’environ 95 %, 97 %, 92 % et 11 % des LNC exprimaient respectivement CD73, CD90, CD105 et SCF, alors qu’ils étaient respectivement de 68 %, 99 %, 20 % et 3 % dans les BMMSC. Le procédé normalisé d’isolement et d’identification des LNC pourrait fournir une base de laboratoire fiable pour l’utilisation généralisée des LNC.
L’incidence du déficit en cellules souches épithéliales cornéennes (CESD), également appelé déficit en cellules souches limbiques (LSCD)1, et de la régénération épithéliale cornéenne (CES) devient de plus en plus urgente en raison des infections et des lésions cornéennes. Si elle n’est pas correctement traitée, la CESD peut entraîner une cécité qui nécessite une greffe de cornée. En conséquence, la régénération du CES devient plus importante. Il existe un groupe de cellules de soutien appelées cellules de niche limbique (LNC) qui fournissent un soutien essentiel à la fonction CES. Les cellules souches stromales limbiques ont d’abord été isolées par Polisetty et al.2 et identifiées par Xie et al.3 comme des LNC qui sont localisées dans l’épithélium limbique sous-jacent et le stroma du limbe. Les LNC sont les principales cellules souches de soutien du bord cornéen et, avec la fonction des CSM dérivées de la moelle osseuse (BMMSC), et pourraient être induites à se développer en cellules épithéliales cornéennes et en cellules stromales cornéennes, etc.3,4,5,6,7. Des études antérieures ont montré que les qualités des cellules souches des LNC sont plus primitives que celles desBMMSCs 8, qui sont déjà largement utilisées en clinique. Les LNC pourraient même devenir la prochaine option viable après la CSM, en particulier pour le traitement du CESD. En tant que cellules de soutien importantes pour le CES, les LNC sont également des cellules souches dérivées de la structure de « niche » du limbe. Les LNC peuvent jouer un rôle clé dans la dédifférenciation des cellules épithéliales cornéennes matures (MCEC) en CES9. Cependant, les études sur les LNC sont encore relativement insuffisantes et il n’y a pas de consensus sur la terminologie, l’isolement, la purification, l’identification et les caractéristiques des LNC. Certains chercheurs ont nommé les cellules souches stromales dérivées de la biopsie limbique10, les cellules souches mésenchymateuses limbiques11, les cellules souches fibroblastiques limbiques 12 et les cellules stromales mésenchymateuses limbiques13. Étant donné que les caractéristiques de croissance des LNC n’ont pas été décrites en détail, et en raison de leurs applications scientifiques et cliniques prometteuses, et qu’elles pourraient être l’un des outils cliniques les plus importants à l’avenir, il est nécessaire de résumer l’isolement, la purification, l’identification et les caractéristiques des LNC.
Selon une étude antérieure14, les LNC sont principalement présents au niveau de l’épithélium limbique sous-jacent et du stroma du limbe. Ce protocole comprend le traitement du tissu limbique à l’aide de la collagénase A, l’obtention d’un cluster composé de LEPC et de LNC, et sa digestion en cellules uniques avec 0,25 % de trypsine-EDTA (TE). Les LNC ont ensuite été sélectivement cultivés dans un milieu de cellules souches embryonnaires modifiées (MESCM) pour être purifiés. Le protocole décrit dans cet article est simple et très efficace pour obtenir des LNC humains en grande quantité.
La procédure détaillée d’isolement, de culture et d’identification du LNC a été enregistrée dans la vidéo pour les scientifiques intéressés par l’étude du LNC, et elle peut être facilement répétée en cas de besoin.
La transparence cornéenne est généralement maintenue par la disposition et la distribution régulières de petites fibres (25 à 30 nm de diamètre) dans le stroma cornéen, ce qui est crucial pour l’acuité visuelle normale16. Il y a 253 millions de personnes malvoyantes dans le monde, dont 36 millions sont aveugles17. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) considère la cécité cornéenne comme l’un des risques les plus graves pour la vue humaine, représent…
The authors have nothing to disclose.
Merci à Wei Wang, Lingjuan Xu et Rong Liu pour les conseils sur ce travail, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You et Li Guigang pour avoir fourni une partie du matériel, Guanyu Su pour l’écriture du manuscrit, Xiao Zhou, Yihong Xiong et Huatao Xie pour la correction du manuscrit, et Guigang Li pour ses conseils complets. Cette étude a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82070936, 81470606, 81570819), projet de recherche scientifique sur la santé et la planification familiale de la province du Hubei (n° 133). WJ2017M073), les dix principaux projets de recherche médicale translationnelle de l’hôpital de Tongji (n° 2016ZHYX20), le projet de formation des jeunes pionniers de la médecine dans la ville de Wuhan (n° 2015whzqnyxggrc10), le programme de recrutement de talents mondiaux (G2022154028L), le projet de la Commission nationale de la santé de la province du Hubei en 2022 (WJ2021ZH0005) et la fondation de construction du département des finances du Hubei en 2022 (42000022815T000000102)
4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | – |
CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | – |
Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | – |
Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | – |
Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | – |
Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
Matrigel | BioCoat | 356234 | – |
Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | – |
Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | – |
SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
Tween 20 | MERCK | P9416 | – |
Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |