ここでは、ヒトの辺縁ニッチ細胞を単離して同定するためのプロトコルを紹介します。
ここでは、辺縁ニッチ細胞(LNC)の単離と同定のための標準的な手順を報告します。アイバンクから得られた辺縁部組織をLNCの単離に使用しました。組織を無菌条件下で12個に分割し、コラゲナーゼAを使用して細胞培養インキュベーターで37°Cで18時間消化し、LNCおよび辺縁上皮前駆細胞を含む細胞クラスターを得ました。細胞クラスターを0.25%トリプシン-EDTAを用いて37°Cで15分間消化し、単一細胞を得た後、5%マトリゲルでコーティングされたプラスチック表面上の改変胚性幹細胞培地(MESCM)で培養しました。細胞は70%のコンフルエンスで継代し、免疫蛍光法、リアルタイム定量PCR(qPCR)、およびフローサイトメトリーを用いてLNCを同定しました。一次LNCを単離し、12回以上継代した。P4からP6にかけてのLNCの増殖活性が最も高かった。LNCは、BMMSC(SCF、Nestin、Rex1、SSEA4、CD73、CD90、MSX1、P75NTR、およびPDGFRβ)よりも高い幹細胞マーカーを発現していました。さらに、P4 LNCはVIM、CD90、CD105、PDGFRβを均一に発現するが、LNCの同定マーカーとして使用できるPan-CKは発現しないことが示された。 フローサイトメトリー解析では、LNCの約95%、97%、92%、および11%がそれぞれCD73、CD90、CD105、およびSCFを発現し、BMMSCでは68%、99%、20%、および3%であることが示されました。LNCの単離と同定のための標準的なプロセスは、LNCを広く使用するための信頼できる実験室基盤を提供する可能性があります。
角膜上皮幹細胞欠損症(LSCD)1、角膜上皮再生症(CES)の発生率は、角膜感染症や外傷によりますます緊急性を増しています。適切に治療しないと、CESDは角膜移植を必要とする失明につながる可能性があります。その結果、CESの再生はより重要になってきています。辺縁ニッチ細胞(LNC)と呼ばれる支持細胞のグループがあり、CES機能に不可欠なサポートを提供します。辺縁間質幹細胞は、Polisettyらによって最初に単離され2、Xieら3によって、辺縁の下皮および辺縁の間質に局在するLNCとして同定されました。LNCは角膜縁を支える幹細胞であり、骨髄由来MSC(BMMSC)の機能を持ち、角膜上皮細胞や角膜間質細胞などに成長を誘導する可能性があります3,4,5,6,7。これまでの研究で、LNCの幹細胞の質は、すでに臨床で広く使用されているBMMSC8よりも原始的であることが示されました。LNCは、特にCESDの治療において、MSCに次ぐ実行可能な選択肢になる可能性さえあります。CESの重要な支持細胞であるLNCは、辺縁部の「ニッチ」構造に由来する幹細胞でもあります。LNCは、成熟角膜上皮細胞(MCEC)のCES9への脱分化に重要な役割を果たす可能性があります。しかし、LNCに関する研究はまだ比較的不十分であり、LNCの用語、単離、精製、同定、および特性に関するコンセンサスはありません。一部の研究者は、LNCを辺縁生検由来間質幹細胞10、辺縁間葉系幹細胞11、辺縁線維芽細胞12、および辺縁間葉系間質細胞13と名付けました。LNCの増殖特性は詳細に記述されておらず、科学的および臨床的応用が有望であり、将来的に最も重要な臨床ツールの1つとなる可能性があるため、LNCの単離、精製、同定、および特性を要約する必要があります。
以前の研究14によると、LNCは主に辺縁の下皮と辺縁の間質に存在します。このプロトコルには、コラゲナーゼAを使用して辺縁組織を処理し、LEPCとLNCからなるクラスターを取得し、0.25%トリプシンEDTA(TE)で単一細胞に消化することが含まれます。次いで、LNCを改変胚性幹細胞培地(MESCM)で選択的に培養し、精製した。この論文で報告されているプロトコルは単純で、ヒトLNCを大量に入手するのに高い効率を持っています。
LNCの単離、培養、同定の詳細な手順は、LNC研究に関心のある科学者のためにビデオに記録されており、必要に応じて便利に繰り返すことができます。
角膜の透明性は、通常、角膜間質における小さな線維(直径25〜30 nm)の規則的な配置と分布によって維持され、これは正常な視力に不可欠です16。世界には2億5,300万人の視覚障害者がおり、そのうち3,600万人が17歳の視覚障害者です。世界保健機関(WHO)は、角膜失明を人間の視力に対する最も深刻な危険の1つと見なしており、世界の全失明の5.1%を占めています…
The authors have nothing to disclose.
本書の指導をしてくれたWei Wang氏、Lingjuan Xu氏、Rong Liu氏、資料の一部を提供してくれたYongyao Tan氏、Bihui Jin氏、Chunxiu You氏、Li Guigang氏、原稿を書いてくれたGuanyu Su氏、原稿の添削をしてくれたXiao Zhou氏、Yihong Xiong氏、Huatao Xie氏、そして完全な指導をしてくれたGuigang Li氏に感謝します。本研究は、中国国家自然科学基金会(第82070936号、81470606年、81570819年)、湖北省保健家族計画科学研究プロジェクト(第1号)の支援を受けて行われました。WJ2017M073)、同済医院のトランスレーショナルメディカル研究プロジェクトトップ10(No.2016ZHYX20)、武漢市若手医療パイオニア育成プロジェクト(No.2015whzqnyxggrc10)、グローバル人材採用プログラム(G2022154028L)、2022年湖北省国家衛生健康委員会プロジェクト(WJ2021ZH0005)、2022年湖北省財政部主題建設財団(42000022815T000000102)
4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | – |
CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | – |
Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | – |
Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | – |
Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | – |
Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
Matrigel | BioCoat | 356234 | – |
Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | – |
Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | – |
SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
Tween 20 | MERCK | P9416 | – |
Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |