Summary
Tiroid Hormon Etki Göstergesi fare modeli, endojen düzenleyici mekanizmasını kullanarak lokal tiroid hormon etkisinin dokuya özgü nicelleştirilmesini sağlamak için geliştirilmiştir. Son zamanlarda, modelin tiroid hormon ekonomisi ile etkileşime giren endokrin bozucu kimyasalları hem ex vivo hem de in vivo metodolojilerle karakterize etmek için uygun olduğu gösterilmiştir.
Abstract
Tiroid hormonları (TH) hücre metabolizmasında ve doku fonksiyonunda kritik bir rol oynar. TH ekonomisi, hormon üretimini veya etkisini bozabilecek endokrin bozucu kimyasallara (EDC'ler) karşı hassastır. Birçok çevresel kirletici, hem insan sağlığı hem de tarımsal üretim için ortaya çıkan bir tehdidi temsil eden EDC'lerdir. Bu, potansiyel EDC'lerin etkilerini incelemek için uygun test sistemlerine olan talebin artmasına neden olmuştur. Bununla birlikte, mevcut metodolojiler zorluklarla karşı karşıyadır. Çoğu test sistemi, doğrudan ve dolaylı etkilerin ayırt edilmesini zorlaştıran çoklu, genellikle karmaşık düzenleyici süreçler tarafından düzenlenen endojen belirteçler kullanır. Ayrıca, in vitro test sistemleri, memelilerde EDC metabolizmasının ve farmakokinetiğin fizyolojik karmaşıklığından yoksundur. Ek olarak, çevresel EDC'lere maruz kalma genellikle in vivo üretilen metabolitler de dahil olmak üzere çoklu bileşiklerin bir karışımını içerir, bu nedenle etkileşim olasılığı göz ardı edilemez. Bu karmaşıklık, EDC karakterizasyonunu zorlaştırır. Tiroid Hormon Etki Göstergesi (THAI) faresi, dokuya özgü TH etkisinin değerlendirilmesini sağlayan, TH'ye duyarlı bir lusiferaz raportör sistemi taşıyan transgenik bir modeldir. Doku örneklerinde lusiferaz raportör ekspresyonunu ölçerek kimyasalların lokal TH etkisi üzerindeki dokuya özgü etkileri değerlendirilebilir. Ayrıca, in vivo görüntüleme ile THAI fare modeli, canlı hayvanlarda potansiyel EDC'lerin etkileri üzerine uzunlamasına çalışmalara izin verir. Bu yaklaşım, aynı hayvanda zaman içinde lokal TH etkisindeki değişikliklerin değerlendirilmesini sağladığından, uzun süreli maruziyeti, karmaşık tedavi yapılarını veya geri çekilmeyi test etmek için güçlü bir araç sağlar. Bu rapor, THAI fareleri üzerinde in vivo görüntüleme ölçümlerinin sürecini açıklamaktadır. Burada tartışılan protokol, kontrol görevi görebilecek hiper ve hipotiroidi farelerin geliştirilmesine ve görüntülenmesine odaklanmaktadır. Araştırmacılar, özel ihtiyaçlarını karşılamak için sunulan tedavileri uyarlayabilir veya genişletebilir ve daha fazla araştırma için temel bir yaklaşım sunabilir.
Introduction
Tiroid hormonu (TH) sinyali, yetişkinlikte normal gelişim ve optimal doku fonksiyonu için gerekli olan hücresel metabolizmanın temel bir düzenleyicisidir1. Dokular içinde, TH eylemi, yerel TH seviyelerinin dokuya özgü bakımına izin veren karmaşık bir moleküler makine tarafından hassas bir şekilde kontrol edilir. Farklı dokuların dolaşımdaki TH seviyelerinden bu özerkliği büyük önem taşımaktadır 2,3,4.
Çok sayıda kimyasal, endokrin fonksiyonlarını bozma potansiyeline sahiptir ve çevrede kirletici olarak bulunur. Bu moleküllerin atık su ve tarımsal üretim yoluyla besin zincirine girebileceği ve böylece çiftlik hayvanlarının ve insanların sağlığını etkileyebileceği giderek artan bir endişe kaynağıdır 5,6,7.
Bu konuyu ele almadaki önemli zorluklardan biri, hem yetkilendirilmiş hem de halihazırda yasaklanmış, ancak hala ısrarla mevcut olan moleküller de dahil olmak üzere, ilgili çok sayıda bileşiktir. Son yıllarda, çeşitli kimyasalların tarama ve yıkıcı potansiyelinin belirlenmesi için test sistemleri geliştirmek için önemli çabalar sarf edilmiştir8,9,10,11. Bu yöntemler, binlerce bileşiğin yüksek verimli taranmasında ve potansiyel tehditlerin belirlenmesinde mükemmel olsa da, bu moleküllerin spesifik in vivo etkilerinin ayrıntılı bir analizi, insan maruziyetinin tehlikelerini belirlemek için esastır. Bu nedenle, endokrin bozucu kimyasalları (EDC'ler) incelerken ve karakterize ederken çok yönlü bir yaklaşım gereklidir.
TH regülasyonu bağlamında, EDC maruziyetinin dokuya özgü sonuçlarını anlamak, lokal TH eyleminin ölçülmesini gerektirir. Bu amaç için birkaç in vivo model geliştirilmiş olsa da, çoğu çıktı ölçüsü olarak endojen belirteçlere güvenir. Fizyolojik olmalarına rağmen, bu belirteçler hem doğrudan hem de dolaylı olarak çok sayıda düzenleyici mekanizmaya tabidir ve bu da yorumlanmalarını daha zor hale getirir. Bu nedenle, EDC'nin doku düzeyinde TH regülasyonu üzerindeki etkilerini karakterize etmek önemli bir zorluk olmaya devam etmektedir12,13.
Dokuya özgü TH sinyalini ölçmenin zorluklarını ele almak için, Tiroid Hormon Eylem Göstergesi (THAI) fare modeli yakın zamanda geliştirilmiştir. Bu model, endojen koşullar altında lokal TH etkisindeki değişikliklerin spesifik olarak ölçülmesine izin verir. Fare genomuna, TH eylemi14 tarafından düzenlemeye oldukça duyarlı olan bir lusiferaz transgeni sokuldu. Bu model,14,15,16,17,18 sinyalini veren lokal doku TH değişikliklerinin ölçülmesini gerektiren çeşitli araştırma sorularını yanıtlamada etkinlik göstermiştir.
THAI modelinin potansiyel bir kullanımının tanınması, EDC'lerin TH sinyali üzerindeki dokuya özgü etkilerini karakterize etmektir. Model, tetrabromobisfenol A ve diclazuril'in TH sinyal15 üzerindeki dokuya özgü etkilerini araştırmak için son zamanlarda başarıyla kullanılmıştır. Burada, TH fonksiyonunu bozan EDC'leri karakterize etmek için bir test sistemi olarak THAI modelinde in vivo görüntüleme tekniklerini kullanmak için temel protokoller sunulmaktadır. Bu yöntem, lusiferin-lusiferaz reaksiyonunun biyolüminesan doğasından yararlanır. Esasen, transgenik olarak eksprese edilen lusiferaz enzimi, uygulanan lusiferinin oksidasyonunu katalize eder ve dokudaki lusiferaz miktarıyla orantılı ışıldayan ışık üretir (Şekil 1). Sonuç olarak, ölçülen biyolojik yanıt, lokal TH eyleminin14 uygun bir ölçüsü olarak doğrulanan lusiferaz aktivitesidir. THAI modeli hemen hemen tüm dokularda TH etkisini ölçmek için uygulanabilirken, in vivo görüntüleme öncelikle ince bağırsakta (ventral görüntüleme) ve interskapular kahverengi yağ dokusunda (BAT, dorsal görüntüleme) TH etkisine odaklanır14.
İn vivo görüntüleme tekniğinin önemli bir avantajı, ölçümler için hayvanları feda etme ihtiyacını ortadan kaldırmasıdır. Bu, araştırmacıların kendi kendini kontrol eden çalışmalar olarak uzunlamasına ve takip deneyleri tasarlamasına olanak tanıyarak, denekler arasındaki önyargıyı ve kullanılan hayvan sayısını azaltır. Bu husus özellikle EDC karakterizasyonunda çok önemlidir ve yöntemin bu amaç için gücü ve çok yönlülüğü daha önce gösterilmiştir14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mevcut protokol, Deneysel Tıp Enstitüsü'ndeki Hayvan Refahı Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (PE/EA/1490-7/2017, PE/EA/106-2/2021). Sunulan veriler FVB/Ant arka plan14, 3 aylık erkek THAI farelerinden (n = 3-6/grup) alınmıştır. FVB/Karınca arka planı Tayland hayvanlarının derilerinde ölçümleri bozabilecek yüksek pigmentli lekeler olma eğilimindedir. Bu nedenle, kürk çıkarıldıktan sonra görüntülenen bölgenin derisinde pigmentli lekeler arayın. Deney özel olarak gerektirmedikçe hayvanlar özel barınma koşullarına ihtiyaç duymazlar (örneğin, özel bir diyet).
1. Hipertiroidi tedavisi
NOT: Farelerde hipertiroidizmi indüklemek için genel bir protokol burada verilmiştir. ATA kılavuzu19 , bahsedilen alternatiflerle yöntemlerin arka planı hakkında ayrıntılı açıklamalar sunar.
- T3'ü (3,5,3'-triiyodotironin, Malzeme Tablosuna bakınız) 40-5 mg / mL arasında bir konsantrasyona sahip bir stok çözeltisi oluşturmak için 10 mM NaOH içinde çözün.
- Stok çözeltisini tuzlu su ile 0.1 μg/μL'lik nihai konsantrasyona seyreltin.
- Seyreltilmiş T3 çözeltisini intraperitoneal olarak (i.p.) vücut ağırlığının gramı başına 10 μL hacimde uyanık hayvanlara enjekte edin (bwg). 24 saat sonra, hayvanlar hipertiroidi olarak kabul edilecektir.
NOT: T3 tedavisi başka herhangi bir tedavi ile değiştirilebilir. Tedavi, in vivo görüntüleme protokolünü etkilemez.
2. Hipotiroidi tedavisi
NOT: Burada, farelerde hipotiroidizmi indüklemek için sadece genel bir protokol sağlanmıştır. ATA kılavuzu19 , bahsedilen alternatiflerle yöntemlerin arka planı hakkında ayrıntılı açıklamalar açıklar.
- Diyeti iyotsuz bir yemek diyetine geçirin ve içme suyuna KClO4 ve metimazol ekleyin (% 0.01 metimazol,% 0.05 KClO4) (bkz.
- İçme solüsyonunu düzenli olarak (2-3 günde bir) taze bir içme solüsyonu ile değiştirin çünkü metimazol ışığa duyarlıdır ve hızla bozulur.
- Tedavi rejimini en az 2 hafta, en fazla 4 hafta sürdürün. Hayvanlar kilo verecek ve rahatsızlık gösterecektir. Hayvanlar neredeyse hiç hareket etmiyorsa, tüylerinin çoğunu kaybetmişse veya zar zor bilinçliyse, insancıl bir son nokta kullanın ve herhangi bir yöntemle (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) sonlandırın.
- Hipotiroidizmden potansiyel iyileşmeyi önlemek için diğer tedavilerle birleştirildiğinde hipotiroid tedavisine devam edin.
3. İn vivo görüntüleme
- In vivo görüntüleme sistemi ile uyumlu yazılımı başlatın (bkz.
- Oturum açın ve "Görüntüleme Sihirbazı" panelinin yüklenmesini bekleyin. Pencerenin sol alt kısmında daha küçük bir paneldir.
- "Imaging Wizard" (Görüntüleme Sihirbazı) panelindeki Initialize (Başlat ) seçeneğine tıklayarak fotoğraf makinesi soğutmasını başlatın. Bu, cihazın bir kurulum protokolü çalıştırmasını sağlar, tamamlanmasını bekleyin. "Görüntüleme Sihirbazı paneli" maviye döner ve kamera sıcaklığı yeterince düşük olduğunda ve cihaz hazır olduğunda panelde yeşil bir ışık yanar.
- Ölçülen hayvanları sıcak tutmak için ısıtma yastığının sıcaklığını 30-37 °C'ye ayarlayın.
NOT: Kamera sıcaklığının optimum olmasını beklerken protokole devam edin. - Hayvanları aletin yakınında tutmayın veya tedavi etmeyin. Cihazın etrafında havada dolaşan fazla miktarda saçtan kaçının.
- 1-3 hayvanı ketamin-ksilazin i.p. enjeksiyonu ile uyuşturun (ketamin 50 mg/kg vücut ağırlığı, ksilazin 10 mg/kg vücut ağırlığı , bkz. Alternatif olarak, bir izofluran anestezik sistemi kuruluysa, ketamin-ksilazin karışımını değiştirerek izofluran anestezisi kullanmak için kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyin.
NOT: Hipotiroidi fareler ketamin-ksilazine daha duyarlıdır; Yarım doz kullanın. - Anestezi sırasında göz koruma jeli kullanın.
- Ayak tabanlarını sıkıştırarak pedal refleksini kontrol edin. Hiçbir pedal refleksi cerrahi düzlem anestezisinin durumunu doğrulamaz.
- Anestezi etkisini gösterdikten sonra, en uygun tüy alma yöntemini (epilatör, tıraş, krem vb.) kullanarak görüntülenen vücut bölgelerinden tüy alın. Işıldayan ışığın dağılmasını önlemek için görüntülenen vücut kısımlarında kürk kalmadığından emin olun.
- Na-lusiferini ( Malzeme Tablosuna bakınız) 15 mg / mL konsantrasyonda 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün. Luciferin ışığa duyarlıdır; Doğrudan ışığa maruz kalmaktan kaçının. Çözeltiyi kehribar tüplerde saklayın veya alüminyum folyoya sarın.
- Tıraşlı hayvanlara lusiferin solüsyonu 10 μL/bwg i.p. uygulayın
- Hayvanları, kameranın merkez noktası ped üzerinde '+' olarak işaretlenmiş olacak şekilde cihaza yerleştirin. Kılavuz çizgilerini kontrol ederek ve emin değilseniz tek bir 'Fotoğraf' çekimi ile onaylayarak doğru yerleştirmeyi sağlayın.
- İlk ölçümü yapmadan önce substrat uygulamasından sonra 15 dakika bekleyin. Bu süre zarfında, "Görüntü Sihirbazı" panelindeki görüntüleme süresini lüminesans için 3 dakikaya ayarlayın ve Fotoğraf ve Lüminesans kutularını işaretleyin. 'Fotoğraf', ölçülen sinyalin kaynağını belirlemek için lüminesans ile çakışması için gereklidir.
NOT: Optimum substrat alımı ve doku dağılımı için 15 dakika gereklidir. Lüminesan sinyal, lusiferin uygulamasından 15-20 dakika sonra platolar. Platodan sonra sinyal yavaş yavaş azalmaya başlar. - "Imaging Wizard" (Görüntüleme Sihirbazı) panelindeki Measure (Ölç ) seçeneğine tıklayarak ilk ölçümü yapın.
- Hem ventral hem de dorsal görüntüleme yapılırsa, ilkini tamamladıktan hemen sonra ikinci vücut kısmının görüntülenmesi için hayvanları yeniden düzenleyin.
- Görüntüleme yapıldıktan sonra, hayvanları kafeslerine geri koyun ve bir sonraki hayvan grubuyla deneye devam edin.
- Hayvanların iyileşmesine izin verin, bu genellikle en fazla 1-2 saat sürer. İyileşmeyi kolaylaştırmak için hayvanların yanına ılık suyla dolu bir tüp yerleştirin ve solunum ve perfüzyon gibi hayati belirtileri izleyin.
- Ölçülen hayvanların kaderine karar verin. Bu makalede sunulan verilerde, ölçülen hayvanlara, ex vivo ölçümler için kurumsal olarak onaylanmış protokoller izlenerek ötenazi uygulandı. Ancak, bu gerekli değildir. Ötenazi veya takip deneylerinin etik olup olmadığını düşünün.
4. Veri analizi
- Yazılımda "ClickInfo" dosyasını açın. Pencerenin sağ tarafında görüntü analizi ve düzenleme için "Araç Paleti" adlı bir panel açılacaktır.
- Görüntünün sol üst köşesindeki ölçeği parlaklığa dönüştürün.
- "Görüntü Ayarı"na tıklayın.
- Görüntülerin en uygun gruplamasına ve renk ölçeğine karar verin. Tüm görüntülerin aynı ayarları kullanmasını sağlayın.
- "Araç paleti"ndeki "ROI araçları" na tıklayın.
- "ROI araçları"nda "ROI'yi Yerleştir"e tıklayarak ilgi alanlarını seçin. Deneysel tasarıma bağlı olarak aynı büyüklükteki ROI'leri veya farklı büyüklükteki ROI'leri kullanmak da anlamlı olabilir.
- "ROI'leri Ölç"e tıklayın. Yerleştirilen ROI'lerin verilerini içeren yeni bir pencere açılacaktır. Verileri ctr + c-ctrl + v Windows komutuyla tercih ettiğiniz bir düzenleme veya istatistik yazılımına aktarın.
- Veriler, toplam akı veya ortalama parlaklık olarak dışa aktarılabilir. Geçerli deneme ayarında hangi değişkenin en alakalı olduğunu seçin.
- Deney tasarımına uygun olarak veri analizine devam edin. (Tedavi edilen arka plan) değerlerin "bir hayvanda ölçülen etki" olarak bireysel olarak hesaplanması önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genel olarak, ölçülen parlaklık 10 5 ila 1010 p/s/cm2/sr büyüklükleri arasında değişir. Bununla birlikte, kesin değerler aynı görüntüdeki hayvanlar arasında ve farklı görüntüler arasında değişebilir. Bu nedenle, ham verileri karşılaştırmak yanıltıcı olabilir. Tüm deneylerde kontrol ve arka plan sinyalleri oluşturmak çok önemlidir, bu da kendi kendini kontrol eden tasarımları şiddetle tavsiye eder.
Şekil 2 , hipo-, eu- ve hipertiroidi fareleri içeren bir deney düzeneğinde ventral ve dorsal görünümlerden elde edilen temsili görüntüleri ve verileri sunmaktadır. Hipotiroidi farelerde en düşük sinyaller beklenir ve genellikle renk skalasının alt sınırının altına düşer.
Ayak tabanları, kuyruk ve burun gibi kürkü olmayan alanlar nispeten yüksek bazal sinyaller sergiler. Önemli olarak, lusiferaz sinyali, Şekil 2'de görüldüğü gibi tiroid hormonu (TH) durumundan etkilenir. Şaşırtıcı bir şekilde, Şekil 3, soğuk stresli THAI farelerinin kahverengi yağ dokusunda (BAT) TH etkisinin önemli ölçüde arttığını göstermektedir14. Bununla birlikte, bu işlem ayak tabanlarındaki ve kuyruktaki lusiferaz sinyalini etkilemez. Bu eşitsizlik, aynı organizmanın dokularında belirgin şekilde farklı TH eylemleri potansiyelinin altını çizmektedir. Soğuğa maruz kalma, tip 2 deiyodinaz aracılı TH aktivasyonunun lokalize yukarı regülasyonunu gerektiren BAT aktivasyonunu tetikler20,21. 24 saatlik soğuğa maruz kaldıktan sonra, dolaşımdaki TH seviyeleri değişmeden kalır, bu da ayak tabanlarında ve kuyrukta TH'ye bağlı sinyal değişikliğine neden olmaz. Buna karşılık, Şekil 2'de sunulan senaryoda, yüksek kan TH seviyelerinin ayak tabanı, kuyruk ve BAT'deki TH eylemini buna bağlı olarak arttırdığı senaryoda.
Hem Şekil 2 hem de Şekil 3 , testis bölgesinde sağlam sinyaller ortaya koymaktadır. Bu, THAI modelinin bir özelliği olan testislerdeki lusiferaz transgeninin TH'den bağımsız yüksek bazal ekspresyonuna atfedilir. Bu organda, lusiferaz sinyali, dolaşımdaki TH seviyelerindeki değişikliklerden etkilenmeden kalır.
Daha önce de belirtildiği gibi, hipo ve hipertiroidi tedavileri, endokrin bozucu bileşiklerin (EDC'ler) test edilmesi gibi diğer müdahalelerle ikame edilebilir. Şekil 4 , EDC potansiyeli16 olan bir veteriner ilacı olan diclazuril'i içeren üç haftalık bir takip deneyinde BAT görüntülemeyi göstermektedir. Zaman noktaları arasındaki sinyaller kolayca ayırt edilebilir ve yöntem, dilazurilin birikimini ve boşluğunu etkili bir şekilde yakalar.
Şekil 1: THAI Yapısının konsepti ve çalışma prensipleri. (A) Rekombinant THAI yapısı. Bu rakam Mohácsik ve ark.14'ten uyarlanmıştır. (B) Lusiferaz katalizli lusiferin oksidasyonunun şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hipo-, eu- ve hipertiroidi THAI Farelerinin temsili dorsal ve ventral görüntüleri, lusiferaz aktivitesinin yoğunluk diyagramı ile birlikte. (A) Hipo-, eu- ve hipertiroidi THAI farelerinin temsili görüntüleri. (B) (A)'daki sinyallerin nicelleştirilmesi. Ortalama foton/lar ± SEM (n = 3). *P < 0,05; P < 0.001, tek yönlü ANOVA ile belirlendi, ardından Newman-Keuls post hoc testi. Bu rakam Mohácsik ve ark.14'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Soğuk stresten önce ve sonra pençe, kuyruk ve BAT sinyalleri, lusiferaz aktivitesinin ışık yoğunluğu diyagramı ile birlikte. (A) Kontrol ve soğuk stresli THAI farelerinin temsili dorsal görüntüleri. (B) (A)'daki sinyallerin nicelleştirilmesi. Ortalama foton/s ± SEM (n = 4). **P < 0.001, Student'ın t-testi ile belirlenir. Bu rakam Mohácsik ve ark.14'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Lusiferaz aktivitesinin ışık yoğunluğu diyagramı ile birlikte üç haftalık bir diclazuril takip çalışmasının temsili BAT görüntüleri. THAI fareleri, salin süspansiyonu olarak 10 mg / bwkg / gün diclazuril ile 2 hafta boyunca oral olarak tedavi edildi ve ardından bir haftalık iyileşme sağlandı. (A) Diclazuril tedavisi öncesinde, sırasında ve sonrasında (B)'de BAT biyolüminesan sinyallerinin miktarının belirlenmesi. (B) Diclazuril tedavisi öncesinde, sırasında ve sonrasında THAI farelerinin temsili dorsal görüntüleri. n = 4-6 fare/grup; şekil, foton/s'nin Tukey Kutusu Grafiğini gösterir, α = 0.05; : p < 0.001. Bu şekil Sinko ve ark.15'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endokrin Bozucu Kimyasalların (EDC'ler) insan sağlığına yönelik tehditleri iyi bilinmektedir; bununla birlikte, EDC'ler üzerine yapılan araştırmalar zorlu zorluklarla karşı karşıyadır. Bu zorluklar kısmen endokrin sistemin karmaşıklığının bir sonucudur. Birçok EDC'nin aynı anda birden fazla endokrin sistemi bozduğu tespit edilmiştir22. Ek olarak, Tiroid Hormonu (TH) ekonomisi bağlamında, TH etkisinin düzenlenmesinde dokuya özgü farklılıklar nedeniyle ek bir karmaşıklık katmanı vardır. Bu karmaşıklık, çeşitli dokularda TH eylemini karakterize ederek TH sinyalinin değerlendirmesini genişletmeye yönelik yeni bir bakış açısı sağlar. Zorluk, endokrin sistem üzerindeki etkilerini artırabilen veya azaltabilen bileşiklerin metabolizması ile daha da kötüleşir. Bileşikleri tanımlamak için mevcut tarama yöntemlerinin iyi kurulmuş olduğunu ve yüksek performansla çalıştığını belirtmek önemlidir 8,11. Bununla birlikte, tanımlanan bileşiklerin dokuya özgü etkilerini ve sonuçlarını karakterize etmek için hala test sistemleri eksikliği vardır.
THAI fare modeli, dokuya özgü tiroid hormon ekonomisini karakterize etmenin zorluklarının üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. Potansiyeli çeşitli koşullar altında gösterilmiştir 14,15,16,18. THAI modeli, tiroid hormonlarını bozan kimyasalların karakterize edilmesinde avantaj sağlar. Modelin hızlı bileşik tarama için tasarlanmadığını, ancak in vivo memeli modelinde bozulma mekanizmaları hakkında bilgi sağlamak için tasarlandığını belirtmek önemlidir.
Bu makalede, THAI faresinin in vivo görüntüleme çalışmaları için nasıl kullanılabileceğini özetleyen bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem, hayvanlarda Hipotalamus-Hipofiz-Tiroid (HPT) eksenini ve/veya tiroid hormon etkisini etkileyen tedavilerin test edilmesini sağlar. Protokol, kendi kendini kontrol eden çalışmaları ve takip tasarımlarını destekler. Ek olarak, protokol, deneysel ortamlarda referans olarak hizmet eden çeşitli tiroid hormon durumlarına sahip kontrol hayvanları oluşturmak için kullanılabilir. Sunulan hipo ve hipertiroidi tedavileri gerektiğinde değiştirilebilir, genişletilebilir ve diğer tedavilerle birleştirilebilir. Bu çok yönlülük, özellikle endokrin bozucu kimyasal (EDC) karakterizasyonu için doku tiroid hormon ekonomisini değerlendirmek için değerlidir.
Dorsal taraftaki in vivo görüntüleme sinyalleri Kahverengi Yağ Dokusundan (BAT) gelirken, ventral sinyaller ince bağırsaklardankaynaklanır 14. Bu nedenle, yöntem öncelikle bu dokuları karakterize eder ve diğer vücut kısımlarını ölçmek zor olabilir. Organ maruziyeti yoluyla bu teknik sınırlamaların üstesinden gelmek, etik ve teknik sonuçların dikkatli bir şekilde değerlendirilmesini gerektirir.
THAI modelinde in vivo görüntülemenin ex vivo çalışmalarla birleştirilmesi, çeşitli dokularda ve beyin bölgelerinde tiroid hormon sinyalinin değerlendirilmesine olanak tanır14. Örneğin, qPCR, in vivo görüntülemede görülen etkileri genişletebilir ve belirleyebilir. Ancak bu, takip ve kendi kendini kontrol eden tasarımlardan ödün verir, bu nedenle maliyetler ve faydalar değerlendirilmelidir. Kapsamlı bir inceleme için in vivo görüntülemenin ex vivo ölçümlerle birleştirilmesi önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Proje no. Ulusal Translasyonel Sinirbilim Laboratuvarı başlıklı RRF-2.3.1-21-2022-00011, Széchenyi Plan Plus Programı çerçevesinde Avrupa Birliği Kurtarma ve Dayanıklılık Tesisi tarafından sağlanan destekle hayata geçirilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,5,3'-triiodothyronine (T3) | Merck | T2877 | |
| Animals, mice | THAI mouse | ||
| Eye protection gel | Oculotect | 1000 IU/g | |
| Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | 50 mL volume | |
| Iodine-free chow diet | Research Diets | custom | |
| IVIS Lumina II in vivo imaging system | Perkin Elmer | - | |
| Ketamine | Vetcentre | E1857 | |
| Living Image software 4.5 | Perkin Elmer | - | provided with the instrument |
| Measuring cylinder | 250 mL | ||
| methimazole | Merck | M8506 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | For diluting treatment materials | |
| NaClO4 | Merck | 71852 | |
| Na-luciferin, substrate | Goldbio | 103404-75-7 | |
| NaOH | Merck | 101052833 | |
| Phoshphate buffer saline | Chem Cruz | sc-362302 | |
| Pipette | Gilson | For diluting treatment materials | |
| Pipette tips | Axygen | For diluting treatment materials | |
| Shaving cream/epilator/shaver | Personal preference | ||
| Syringe | B Braun | 1 mL volume | |
| Syringe needle | B Braun | 0.3 x 12 mm | |
| Xylazine | Vetcentre | E1852 |
References
- Larsen, P. R., Davies, T. F., Hay, I. D. Williams Textbook of Endocrinology. Wilson, J. D., Foster, D. W., Kronenberg, H. M., Larsen, P. R. , W.B. Saunders Co. 389-515 (1998).
- Gereben, B., et al. Cellular and molecular basis of deiodinase-regulated thyroid hormone signaling. Endocr Rev. 29 (7), 898-938 (2008).
- Fekete, C., Lechan, R. M. Central regulation of hypothalamic-pituitary-thyroid axis under physiological and pathophysiological conditions. Endocr Rev. 35 (2), 159-194 (2014).
- Bianco, A. C., et al. Paradigms of Dynamic Control of Thyroid Hormone Signaling. Endocr Rev. 40 (4), 1000-1047 (2019).
- Zoeller, R. T. Endocrine disrupting chemicals and thyroid hormone action. Adv Pharmacol. 92, 401-417 (2021).
- Guarnotta, V., Amodei, R., Frasca, F., Aversa, A., Giordano, C. Impact of chemical endocrine disruptors and hormone modulators on the endocrine system. Int J Mol Sci. 23 (10), 5710 (2022).
- La Merrill, M. A., et al. Consensus on the key characteristics of endocrine-disrupting chemicals as a basis for hazard identification. Nat Rev Endocrinol. 16 (1), 45-57 (2020).
- Fini, J. B., et al. An in vivo multiwell-based fluorescent screen for monitoring vertebrate thyroid hormone disruption. Environ Sci Technol. 41 (16), 5908-5914 (2007).
- Mughal, B. B., Fini, J. B., Demeneix, B. A. Thyroid-disrupting chemicals and brain development: an update. Endocr Connect. 7 (4), 160-186 (2018).
- Dong, M., Li, Y., Zhu, M., Li, J., Qin, Z. Tetrabromobisphenol a disturbs brain development in both thyroid hormone-dependent and -independent manners in xenopus laevis. Molecules. 27 (1), 249 (2021).
- Beck, K. R., Sommer, T. J., Schuster, D., Odermatt, A. Evaluation of tetrabromobisphenol A effects on human glucocorticoid and androgen receptors: A comparison of results from human- with yeast-based in vitro assays. Toxicology. 370, 70-77 (2016).
- Li, J., Li, Y., Zhu, M., Song, S., Qin, Z. A multiwell-based assay for screening thyroid hormone signaling disruptors using thibz expression as a sensitive endpoint in xenopus laevis. Molecules. 27 (3), 798 (2022).
- Myosho, T., et al. Preself-feeding medaka fry provides a suitable screening system for in vivo assessment of thyroid hormone-disrupting potential. Environ Sci Technol. 56 (10), 6479-6490 (2022).
- Mohacsik, P., et al. A Transgenic mouse model for detection of tissue-specific thyroid hormone action. Endocrinology. 159 (2), 1159-1171 (2018).
- Sinko, R., et al. Tetrabromobisphenol A and diclazuril evoke tissue-specific changes of thyroid hormone signaling in male thyroid hormone action indicator Mice. Int J Mol Sci. 23 (23), 14782 (2022).
- Sinko, R., et al. Different hypothalamic mechanisms control decreased circulating thyroid hormone levels in infection and fasting-induced non-thyroidal illness syndrome in male thyroid hormone action indicator mice. Thyroid. 33 (1), 109-118 (2023).
- Salas-Lucia, F., et al. Axonal T3 uptake and transport can trigger thyroid hormone signaling in the brain. Elife. 12, 82683 (2023).
- Liu, S., et al. Triiodothyronine (T3) promotes brown fat hyperplasia via thyroid hormone receptor alpha mediated adipocyte progenitor cell proliferation. Nat Commun. 13 (1), 3394 (2022).
- Bianco, A. C., et al. American thyroid association guide to investigating thyroid hormone economy and action in rodent and cell models. Thyroid. 24 (1), 88-168 (2014).
- Silva, J. E., Larsen, P. R. Adrenergic activation of triiodothyronine production in brown adipose tissue. Nature. 305 (5936), 712-713 (1983).
- Bianco, A. C., Silva, J. E. Intracellular conversion of thyroxine to triiodothyronine is required for the optimal thermogenic function of brown adipose tissue. J Clin Invest. 79 (1), 295-300 (1987).
- Caporale, N., et al. From cohorts to molecules: Adverse impacts of endocrine disrupting mixtures. Science. 375 (6582), 8244 (2022).
