Um Sistema de Cultura Automatizado para Manutenção e Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para um sistema automatizado de cultura de células. Este sistema de cultura automatizado reduz o trabalho e beneficia os usuários, incluindo pesquisadores não familiarizados com o manuseio de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS), desde a manutenção de células iPS até a diferenciação em vários tipos de células.
Abstract
Espera-se que as células-tronco pluripotentes induzidas pelo ser humano (hiPSCs) com infinita capacidade de autoproliferação tenham aplicações em vários campos, incluindo a elucidação de patologias de doenças raras, o desenvolvimento de novos medicamentos e a medicina regenerativa com o objetivo de restaurar órgãos danificados. Apesar disso, a implementação social de hiPSCs ainda é limitada. Isso se deve, em parte, à dificuldade de reproduzir a diferenciação na cultura, mesmo com conhecimentos avançados e habilidades técnicas sofisticadas, devido à alta sensibilidade das iPSCs a mudanças ambientais diminutas. A aplicação de um sistema de cultura automatizado pode resolver essa questão. Experimentos com alta reprodutibilidade, independentemente da habilidade do pesquisador, podem ser esperados de acordo com um procedimento compartilhado entre vários institutos. Embora vários sistemas de cultura automatizados que podem manter culturas iPSC e induzir diferenciação tenham sido desenvolvidos anteriormente, esses sistemas são pesados, grandes e caros, pois fazem uso de braços robóticos humanizados e multiarticulados. Para melhorar as questões acima, desenvolvemos um novo sistema usando um sistema simples de trilho deslizante de eixo x-y-z, permitindo que ele seja mais compacto, leve e barato. Além disso, o usuário pode facilmente modificar parâmetros no novo sistema para desenvolver novas tarefas de manuseio. Uma vez que uma tarefa é estabelecida, tudo o que o usuário precisa fazer é preparar o iPSC, fornecer os reagentes e consumíveis necessários para a tarefa desejada com antecedência, selecionar o número da tarefa e especificar o tempo. Confirmamos que o sistema poderia manter as iPSCs em um estado indiferenciado através de várias passagens sem células alimentadoras e diferenciar-se em vários tipos celulares, incluindo cardiomiócitos, hepatócitos, progenitores neurais e queratinócitos. O sistema permitirá experimentos altamente reprodutíveis em todas as instituições sem a necessidade de pesquisadores qualificados e facilitará a implementação social de hiPSCs em uma gama mais ampla de campos de pesquisa, diminuindo os obstáculos para novas entradas.
Introduction
Este artigo tem como objetivo fornecer procedimentos reais e detalhados de manejo para um sistema automatizado de cultura de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSC), que produzimos em colaboração com uma empresa, e mostrar resultados representativos.
Desde a publicação do artigo em 2007, o iPSC vem chamando a atenção em todo o mundo1. Devido à sua maior característica de poder diferenciar-se em qualquer tipo de célula somática, espera-se que seja aplicado em vários campos, como a medicina regenerativa, a elucidação das causas de doenças intratáveis e o desenvolvimento de novos fármacosterapêuticos2,3. Além disso, o uso de células somáticas humanas derivadas de iPSC poderia reduzir os experimentos com animais, que estão sujeitos a restrições éticas significativas. Embora inúmeras iPSCs homogêneas sejam constantemente necessárias para pesquisar novos métodos com iPSCs, é muito trabalhoso gerenciá-las. Além disso, o manuseio de iPSC é difícil devido à sua alta sensibilidade, mesmo a mudanças culturais e ambientais sutis.
Para resolver esse problema, espera-se que os sistemas de cultura automatizados executem tarefas em vez de humanos. Alguns grupos desenvolveram alguns sistemas automatizados de cultura de células-tronco pluripotentes humanas para manutenção e diferenciação celular e publicaram suas conquistas 4,5,6. Estes sistemas equipam braço(s) robótico(s) multiarticulado(s). Os braços robóticos têm não apenas mérito por imitar altamente os movimentos dos braços humanos, mas também demérito por exigirem custos mais altos para o(s) braço(s), embalagens de sistemas maiores e mais pesadas e esforços demorados de educação por parte dos engenheiros para obter os movimentos visados 7,8. A fim de facilitar a introdução do aparelho em mais instalações de pesquisa nos pontos de consumo econômico, espacial e de recursos humanos, desenvolvemos um novo sistema de cultura automatizado para a manutenção e diferenciação de iPSC em vários tipos de células9.
Nossa justificativa para o novo sistema foi adotar um sistema de trilhos com eixo X-Y-Z em vez de braços robóticos multiarticulados9. Para substituir as complexas funções manuais dos braços robóticos, aplicamos uma nova ideia a este sistema, que pode alterar automaticamente três tipos de pontas de braço funcionais específicas. Aqui, também indicamos como os usuários podem facilmente fazer agendamentos de tarefas com pedidos simples em software devido à falta de requisitos para contribuições de engenheiros durante todo o processo.
Um dos sistemas robóticos de cultura demonstrou a confecção de corpos embrionários utilizando placas de 96 poços como agregados celulares 3D paradiferenciação4. O sistema relatado aqui não pode lidar com placas de 96 poços. Um deles alcançou o grau atual de boas práticas de fabricação (GMPc) usando uma linhagem celular, embora não fosse uma célula-tronco pluripotente humana5. O sistema de cultura automatizado aqui detalhado foi desenvolvido com o objetivo específico de auxiliar os experimentos laboratoriais (Figura 1). No entanto, tem sistemas suficientes para manter limpos níveis equivalentes a um gabinete de segurança de nível IV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma etapa crítica no protocolo é que, se um usuário encontrar alguma falha, clique no botão cancelar, parar ou redefinir a qualquer momento e recomeçar a partir da primeira etapa. O software pode evitar erros humanos, incluindo reserva dupla, abertura de portas enquanto as tarefas do sistema estão ativas e falta de reabastecimento. Outro ponto crítico para o sucesso e a diferenciação eficiente da célula somática desejada é a seleção adequada de linhagens de células-tronco pluripotentes, pois cada célula-t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado por uma bolsa do New Business Promotion Center, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japão.
Materials
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
Referências
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