Автоматизированная система культивирования для поддержания и дифференцировки индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток
Summary
Здесь мы представляем протокол для автоматизированной системы культивирования клеток. Эта автоматизированная система культивирования сокращает трудозатраты и приносит пользу пользователям, в том числе исследователям, незнакомым с обращением с индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (iPS), от поддержания iPS-клеток до дифференцировки в различные типы клеток.
Abstract
Ожидается, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) с бесконечной способностью к самораспространению найдут применение во многих областях, включая выяснение патологий редких заболеваний, разработку новых лекарств и регенеративную медицину, направленную на восстановление поврежденных органов. Несмотря на это, социальное применение ИПСК по-прежнему ограничено. Отчасти это связано с трудностью воспроизведения дифференциации в культуре, даже при наличии продвинутых знаний и сложных технических навыков, из-за высокой чувствительности ИПСК к мельчайшим изменениям окружающей среды. Решить эту проблему может применение автоматизированной системы культуры. Эксперименты с высокой воспроизводимостью, не зависящие от квалификации исследователя, можно ожидать в соответствии с общей процедурой для различных институтов. Несмотря на то, что ранее было разработано несколько автоматизированных систем культивирования, которые могут поддерживать культуры ИПСК и индуцировать дифференциацию, эти системы являются тяжелыми, большими и дорогостоящими, поскольку в них используются гуманизированные, многошарнирные роботизированные руки. Чтобы решить вышеуказанные проблемы, мы разработали новую систему, использующую простую систему направляющих по осям x-y-z, что позволило сделать ее более компактной, легкой и дешевой. Кроме того, пользователь может легко изменять параметры в новой системе для разработки новых задач по обработке. После того, как задача поставлена, все, что нужно сделать пользователю, это подготовить iPSC, заранее поставить реагенты и расходные материалы, необходимые для выполнения нужной задачи, выбрать номер задачи и указать время. Мы подтвердили, что система может поддерживать ИПСК в недифференцированном состоянии через несколько пассажей без фидерных клеток и дифференцироваться в различные типы клеток, включая кардиомиоциты, гепатоциты, нейральные предшественники и кератиноциты. Система позволит проводить высоковоспроизводимые эксперименты в разных учреждениях без необходимости в квалифицированных исследователях и будет способствовать социальному внедрению ИПСК в более широкий спектр областей исследований, уменьшая препятствия для новых заявок.
Introduction
Цель данной статьи – представить реальные и подробные процедуры работы с автоматизированной системой культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК), которую мы создали в сотрудничестве с компанией, и показать репрезентативные результаты.
С момента публикации статьи в 2007 году ИПСК привлекает внимание во всем мире1. Из-за его величайшей особенности дифференцироваться в любой тип соматических клеток, ожидается, что он будет применяться в различных областях, таких как регенеративная медицина, выяснение причин трудноизлечимых заболеваний и разработка новых терапевтическихпрепаратов. Кроме того, использование соматических клеток, полученных из ИПСК человека, может сократить количество экспериментов на животных, которые подвергаются значительным этическим ограничениям. Несмотря на то, что для исследования новых методов с помощью ИПСК постоянно требуется большое количество однородных ИПСК, управление ими слишком трудоемко. Кроме того, обращение с ИПСК затруднено из-за его высокой чувствительности, даже к незначительным культурным и экологическим изменениям.
Чтобы решить эту проблему, предполагается, что автоматизированные системы культуры будут выполнять задачи вместо людей. Некоторые группы разработали несколько автоматизированных систем культивирования плюрипотентных стволовых клеток человека для поддержания и дифференцировки клеток и опубликовали свои достижения 4,5,6. Эти системы оснащены многошарнирными роботизированными манипуляторами. Достоинства роботизированных манипуляторов заключаются не только в том, что они в высокой степени имитируют движения человеческой руки, но и в том, что они требуют более высокой стоимости манипулятора (рук), более крупной и тяжелой системы и трудоемких усилий инженеров по обучению для получения целенаправленных движений 7,8. Для того, чтобы облегчить внедрение аппарата в большее количество исследовательских учреждений в точках экономического, космического и человеческого потребления, мы разработали новую автоматизированную систему культивирования для поддержания и дифференцировки ИПСК в различные типы клеток9.
Наше обоснование для новой системы заключалось в том, чтобы использовать рельсовую систему осей X-Y-Z вместо многошарнирных роботизированных манипуляторов9. Чтобы заменить сложные функции роботизированных манипуляторов, мы применили новую идею к этой системе, которая может автоматически изменять три типа конкретных функциональных наконечников манипуляторов. Здесь мы также покажем, как пользователи могут легко составлять графики задач с помощью простых заказов на программное обеспечение из-за отсутствия требований к вкладу инженеров на протяжении всего процесса.
Одна из роботизированных культуральных систем продемонстрировала создание эмбриоидных тел с использованием 96-луночных планшетов в качестве 3D-клеточных агрегатов для дифференцировки4. Система, описанная здесь, не может работать с 96-луночными планшетами. Один из них достиг текущего уровня надлежащей производственной практики (cGMP) с использованием клеточной линии, хотя это не была плюрипотентная стволоваяклетка человека. Автоматизированная система культивирования, описанная здесь, была разработана специально для помощи в лабораторных экспериментах (рис. 1). Тем не менее, он имеет достаточное количество систем для поддержания уровня чистоты, эквивалентного шкафу безопасности уровня IV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критически важным шагом в протоколе является то, что если пользователь обнаружит какие-либо неисправности, нажмите кнопку отмены, остановки или сброса в любое время и начните с первого шага. Программное обеспечение позволяет избежать человеческих ошибок, в том числе двойного брониров?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантом Центра содействия развитию нового бизнеса, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Осака, Япония.
Materials
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
Referências
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
- Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
- Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
- Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647 (2015).
- McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn’t anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
- Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41 (2017).
- Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).
- Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
- Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
- International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).
