मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल को बनाए रखने और अलग करने के लिए एक स्वचालित संस्कृति प्रणाली
Summary
यहां, हम एक स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह स्वचालित संस्कृति प्रणाली श्रम को कम करती है और उपयोगकर्ताओं को लाभ पहुंचाती है, जिसमें प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं को संभालने से अपरिचित शोधकर्ता शामिल हैं, आईपीएस कोशिकाओं के रखरखाव से लेकर विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में भेदभाव तक।
Abstract
अनंत आत्म-प्रसार क्षमता वाले मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) से कई क्षेत्रों में आवेदन होने की उम्मीद की गई है, जिसमें दुर्लभ रोग विकृति की व्याख्या, नई दवाओं का विकास और क्षतिग्रस्त अंगों को बहाल करने के उद्देश्य से पुनर्योजी दवा शामिल है। इसके बावजूद, hiPSCs का सामाजिक कार्यान्वयन अभी भी सीमित है। यह आंशिक रूप से संस्कृति में भेदभाव को पुन: पेश करने की कठिनाई के कारण है, यहां तक कि उन्नत ज्ञान और परिष्कृत तकनीकी कौशल के साथ, आईपीएससी की उच्च संवेदनशीलता के कारण पर्यावरणीय परिवर्तनों को मिनट करने के लिए। एक स्वचालित संस्कृति प्रणाली का अनुप्रयोग इस मुद्दे को हल कर सकता है। एक शोधकर्ता के कौशल से स्वतंत्र उच्च प्रजनन क्षमता के साथ प्रयोगों की उम्मीद विभिन्न संस्थानों में एक साझा प्रक्रिया के अनुसार की जा सकती है। हालांकि कई स्वचालित संस्कृति प्रणालियों है कि IPSC संस्कृतियों को बनाए रखने और भेदभाव प्रेरित कर सकते हैं पहले विकसित किया गया है, इन प्रणालियों भारी हैं, बड़े, और महंगा क्योंकि वे मानवकृत, बहु व्यक्त रोबोट हथियारों का उपयोग करते हैं. उपरोक्त मुद्दों पर सुधार करने के लिए, हमने एक साधारण एक्स-वाई-जेड अक्ष स्लाइड रेल प्रणाली का उपयोग करके एक नई प्रणाली विकसित की, जिससे यह अधिक कॉम्पैक्ट, हल्का और सस्ता हो सके। इसके अलावा, उपयोगकर्ता नए हैंडलिंग कार्यों को विकसित करने के लिए नई प्रणाली में मापदंडों को आसानी से संशोधित कर सकता है। एक बार एक कार्य स्थापित है, सभी उपयोगकर्ता क्या करने की जरूरत है IPSC तैयार है, अग्रिम में वांछित कार्य के लिए आवश्यक अभिकर्मकों और उपभोग्य सामग्रियों की आपूर्ति, कार्य संख्या का चयन करें, और समय निर्दिष्ट. हमने पुष्टि की कि प्रणाली फीडर कोशिकाओं के बिना कई मार्ग के माध्यम से एक उदासीन राज्य में आईपीएससी को बनाए रख सकती है और कार्डियोमायोसाइट्स, हेपेटोसाइट्स, तंत्रिका पूर्वज और केराटिनोसाइट्स सहित विभिन्न सेल प्रकारों में अंतर कर सकती है। प्रणाली कुशल शोधकर्ताओं की आवश्यकता के बिना संस्थानों में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगों को सक्षम करेगी और नई प्रविष्टियों के लिए बाधाओं को कम करके अनुसंधान क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला में एचआईपीएससी के सामाजिक कार्यान्वयन की सुविधा प्रदान करेगी।
Introduction
इस लेख का उद्देश्य मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (आईपीएससी) के लिए एक स्वचालित संस्कृति प्रणाली के लिए वास्तविक और विस्तृत हैंडलिंग प्रक्रियाएं प्रदान करना है, जिसे हमने एक कंपनी के साथ सहयोग करके उत्पादित किया था, और प्रतिनिधि परिणाम दिखाने के लिए।
में लेख के प्रकाशन के बाद से 2007, आईपीएससी दुनिया भर में ध्यान आकर्षित किया गयाहै 1. दैहिक कोशिका के किसी भी प्रकार में अंतर करने में सक्षम होने की अपनी सबसे बड़ी विशेषता के कारण, यह पुनर्योजी चिकित्सा के रूप में विभिन्न क्षेत्रों में लागू होने की उम्मीद है, असाध्य रोगों के कारणों को स्पष्ट करने, और नई चिकित्सीय दवाओं 2,3 के विकास. इसके अलावा, मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न दैहिक कोशिकाओं का उपयोग पशु प्रयोगों को कम कर सकता है, जो महत्वपूर्ण नैतिक प्रतिबंधों के अधीन हैं। हालांकि कई सजातीय IPSC लगातार IPSC के साथ नए तरीकों अनुसंधान करने के लिए आवश्यक हैं, यह भी उन्हें प्रबंधित करने के लिए श्रमसाध्य है. अतिरिक्त, IPSC हैंडलिंग अपनी उच्च संवेदनशीलता की वजह से मुश्किल है, यहां तक कि सूक्ष्म सांस्कृतिक और पर्यावरणीय परिवर्तन करने के लिए.
इस समस्या को हल करने के लिए, स्वचालित संस्कृति प्रणालियों से मनुष्यों के बजाय कार्य करने की अपेक्षा की जाती है। कुछ समूहों ने सेल रखरखाव और भेदभाव के लिए कुछ स्वचालित मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल कल्चर सिस्टम विकसित किए हैं और अपनी उपलब्धियोंको 4,5,6प्रकाशित किया है। ये सिस्टम मल्टीआर्टिकुलेटेड रोबोटिक आर्म (ओं) से लैस हैं। रोबोटिक हथियारों में न केवल योग्यता है कि वे मानव हाथ आंदोलनों की अत्यधिक नकल करते हैं, बल्कि इसमें भी अवगुण हैं कि उन्हें हाथ (ओं) के लिए उच्च लागत (ओं), बड़ी और भारी प्रणाली पैकेजिंग, और इंजीनियरों द्वारा लक्षित आंदोलनों 7,8 प्राप्त करने के लिए समय लेने वाली शिक्षा प्रयासों की आवश्यकता होती है। आदेश में यह आसान आर्थिक के बिंदुओं पर अधिक अनुसंधान सुविधाओं के लिए तंत्र शुरू करने के लिए बनाने के लिए, अंतरिक्ष, और मानव संसाधन खपत, हम रखरखाव और विभिन्न सेल प्रकार9 में IPSC के भेदभाव के लिए एक उपन्यास स्वचालित संस्कृति प्रणाली विकसित की है.
नई प्रणाली के लिए हमारा तर्क बहु-व्यक्त रोबोटिक हथियारों के बजाय एक्स-वाई-जेड अक्ष रेल प्रणाली को अपनाना था9. रोबोटिक हथियारों के जटिल हाथ जैसे कार्यों को बदलने के लिए, हमने इस प्रणाली में एक नया विचार लागू किया, जो स्वचालित रूप से तीन प्रकार के विशिष्ट कार्यात्मक आर्म टिप्स को बदल सकता है। यहां, हम यह भी संकेत देते हैं कि पूरी प्रक्रिया में इंजीनियरों के योगदान के लिए आवश्यकताओं की कमी के कारण उपयोगकर्ता सॉफ़्टवेयर पर सरल ऑर्डर के साथ आसानी से कार्य शेड्यूल कैसे बना सकते हैं।
रोबोटिक संस्कृति प्रणालियों में से एक ने भेदभाव4 के लिए 3 डी सेल समुच्चय के रूप में 96-अच्छी प्लेटों का उपयोग करके भ्रूण निकायों के निर्माण का प्रदर्शन किया है। यहां रिपोर्ट की गई प्रणाली 96-अच्छी प्लेटों को संभाल नहीं सकती है। एक ने सेल लाइन का उपयोग करके वर्तमान अच्छा विनिर्माण अभ्यास (सीजीएमपी) ग्रेड हासिल किया, हालांकि यह मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल5 नहीं था। यहाँ विस्तृत स्वचालित संस्कृति प्रणाली अब प्रयोगशाला प्रयोगों (चित्रा 1) की मदद करने के विशिष्ट उद्देश्य के साथ विकसित किया गया है. हालांकि, इसमें स्तर IV सुरक्षा कैबिनेट के बराबर स्वच्छ स्तर रखने के लिए पर्याप्त प्रणालियां हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम यह है कि यदि किसी उपयोगकर्ता को कोई दोष मिलता है, तो किसी भी समय रद्द करें, रोकें या रीसेट करें बटन पर क्लिक करें और पहले चरण से शुरू करें। सॉफ्टवेयर मानवीय गलतियों से बच स…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को न्यू बिजनेस प्रमोशन सेंटर, पैनासोनिक प्रोडक्शन इंजीनियरिंग कं, लिमिटेड, ओसाका, जापान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
Referências
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