Ett automatiserat odlingssystem för att underhålla och differentiera humaninducerade pluripotenta stamceller
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för ett automatiserat cellodlingssystem. Detta automatiserade odlingssystem minskar arbetskraften och gynnar användarna, inklusive forskare som inte är bekanta med att hantera inducerade pluripotenta stamceller (iPS), från underhåll av iPS-celler till differentiering till olika typer av celler.
Abstract
Humaninducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) med oändlig självförökande förmåga har förväntats ha tillämpningar inom många områden, inklusive klarläggande av patologier för sällsynta sjukdomar, utveckling av nya läkemedel och regenerativ medicin som syftar till att återställa skadade organ. Trots detta är den sociala implementeringen av hiPSC fortfarande begränsad. Detta beror delvis på svårigheten att reproducera differentiering i kulturen, även med avancerad kunskap och sofistikerade tekniska färdigheter, på grund av iPSC:s höga känslighet för små miljöförändringar. Tillämpningen av ett automatiserat odlingssystem kan lösa detta problem. Experiment med hög reproducerbarhet oberoende av en forskares skicklighet kan förväntas enligt en gemensam procedur mellan olika institut. Även om flera automatiserade odlingssystem som kan upprätthålla iPSC-kulturer och inducera differentiering har utvecklats tidigare, är dessa system tunga, stora och kostsamma eftersom de använder sig av humaniserade, multiartikulerade robotarmar. För att förbättra ovanstående problem utvecklade vi ett nytt system med hjälp av ett enkelt x-y-z-axelglidskenesystem, vilket gör att det kan vara mer kompakt, lättare och billigare. Dessutom kan användaren enkelt ändra parametrar i det nya systemet för att utveckla nya hanteringsuppgifter. När en uppgift har upprättats är allt användaren behöver göra att förbereda iPSC, tillhandahålla de reagenser och förbrukningsvaror som behövs för den önskade uppgiften i förväg, välja uppgiftsnummer och ange tiden. Vi bekräftade att systemet kunde upprätthålla iPSCs i ett odifferentierat tillstånd genom flera passager utan matarceller och differentiera till olika celltyper, inklusive kardiomyocyter, hepatocyter, neurala stamceller och keratinocyter. Systemet kommer att möjliggöra mycket reproducerbara experiment mellan institutioner utan behov av skickliga forskare och kommer att underlätta det sociala genomförandet av hiPSC inom ett bredare spektrum av forskningsområden genom att minska hindren för nya inträden.
Introduction
Denna artikel syftar till att tillhandahålla faktiska och detaljerade hanteringsprocedurer för ett automatiserat odlingssystem för humaninducerade pluripotenta stamceller (iPSC), som vi producerade genom att samarbeta med ett företag, och att visa representativa resultat.
Sedan publiceringen av artikeln 2007 har iPSC väckt uppmärksamhet över hela världen1. På grund av dess största egenskap att kunna differentiera till vilken typ av somatisk cell som helst, förväntas den kunna tillämpas inom olika områden såsom regenerativ medicin, belysa orsakerna till svårbehandlade sjukdomar och utveckla nya terapeutiska läkemedel 2,3. Dessutom skulle användningen av humana iPSC-härledda somatiska celler kunna minska djurförsöken, som är föremål för betydande etiska restriktioner. Även om många homogena iPSC:er ständigt krävs för att forska fram nya metoder med iPSC:er, är det för mödosamt att hantera dem. Dessutom är det svårt att hantera iPSC på grund av dess höga känslighet, även för subtila kulturella och miljömässiga förändringar.
För att lösa detta problem förväntas automatiserade odlingssystem utföra uppgifter istället för människor. Vissa grupper har utvecklat ett fåtal automatiserade humana pluripotenta stamcellsodlingssystem för cellunderhåll och differentiering och publicerat sina resultat 4,5,6. Dessa system är utrustade med flerledade robotarmar. Robotarmar har inte bara fördelar genom att de i hög grad efterliknar mänskliga armrörelser utan också nackdelar genom att de kräver högre kostnader för armen/armarna, större och tyngre systemförpackningar och tidskrävande utbildningsinsatser av ingenjörerna för att uppnå de riktade rörelserna 7,8. För att göra det lättare att introducera apparaten till fler forskningsanläggningar vid tidpunkterna för ekonomisk, rymd- och personalförbrukning har vi utvecklat ett nytt automatiserat odlingssystem för underhåll och differentiering av iPSC till olika celltyper9.
Vår motivering för det nya systemet var att anta ett X-Y-Z-axelskensystem istället för multiledade robotarmar9. För att ersätta de komplexa handliknande funktionerna hos robotarmar tillämpade vi en ny idé på detta system, som automatiskt kan ändra tre typer av specifika funktionella armspetsar. Här visar vi också hur användare enkelt kan göra uppgiftsscheman med enkla beställningar på programvara på grund av bristen på krav på ingenjörernas bidrag under hela processen.
Ett av robotodlingssystemen har demonstrerat tillverkningen av embryoidkroppar med hjälp av 96-brunnars plattor som 3D-cellaggregat för differentiering4. Systemet som redovisas här kan inte hantera 96-hålsplattor. En uppnådde den nuvarande graden god tillverkningssed (cGMP) med hjälp av en cellinje, även om det inte var en human pluripotent stamcell5. Det automatiserade odlingssystemet som beskrivs här har nu utvecklats med det specifika syftet att underlätta laboratorieexperiment (figur 1). Den har dock tillräckligt med system för att hålla rena nivåer som motsvarar ett nivå IV-säkerhetsskåp.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett kritiskt steg i protokollet är att om en användare hittar några fel, klicka på knappen Avbryt, stoppa eller återställ när som helst och börja om från det första steget. Programvaran kan undvika mänskliga misstag, inklusive dubbelbokning, öppna dörrar medan systemuppgifterna är aktiva och brist på påfyllning. En annan kritisk punkt för framgångsrik och effektiv differentiering till den önskade somatiska cellen är rätt val av pluripotenta stamcellslinjer eftersom varje pluripotent stamcell har en o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien finansierades av ett bidrag från New Business Promotion Center, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japan.
Materials
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
Referências
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
- Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
- Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
- Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647 (2015).
- McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn’t anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
- Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41 (2017).
- Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).
- Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
- Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
- International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).
